食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)作为全球常见的恶性肿瘤之一,具有起病隐匿,高侵袭性生长以及手术治疗后病死率、复发率高等临床特征,大多数患者在临床确诊时已经进入中晚期阶段。目前治疗本病的主要方法是手术切除加术后放化疗等,其手术切除率58%～92%。ESCC的高侵袭性和高转移率是预后差的主要原因,不少患者经手术切除后常发生转移与复发,其预后情况依赖于早期诊断。微小RNA(microRNA,miRNAs)是最近发现的一类非编码RNA,在肿瘤的发生、侵袭及转移等病理生理过程中扮演着非常重要的作用。miRNAs 一方面可作为癌基因下调抑癌基因的表达促进肿瘤细胞的生长,另一方面又可作为抑癌基因在转录后水平与原癌基因结合,抑制其表达,从而抑制肿瘤的生长。近来研究表明,miRNAs异常表达即表达上调或下调可能与人类多种肿瘤的发生及转移相关,因此作为目前最受关注的生物分子之一,成为肿瘤病理学领域的研究热点。近来在肿瘤研究的领域中备受关注的热点问题主要包括miRNAs基因表达谱的筛选,靶基因预测及相互调控的功能研究等。在ESCC的发生、发展及侵袭转移中,miRNAs所扮演的重要角色受到人们越来越多的关注,对于那些参与了 ESCC的发生、发展及侵袭转移进程的特异性的miRNAs,有可能会成为临床工作中指导其早期诊断及判断病程进展、预后的临床标志物。然而在ESCC的进展及转移中,关于特异性miRNAs所发挥的作用仍处于探索阶段。因此,本研究选用表达谱基因芯片技术对ESCC进行表达谱研究,从中筛选出特异性的miRNAs。紧接着我们选择细胞株及追加大样本组织对其进行功能及调控机制方面的相关研究。利用生物信息学分析,筛选出miRNAs可能的靶基因,并在基因水平上验证靶基因与miRNAs的关系,从而揭示miRNAs通过调节其靶基因促进ESCC的浸润和转移。研究目的1、应用miRNAs表达谱基因芯片技术,探讨ESCC患者淋巴结转移组和无淋巴结转移组差异性表达的miRNAs。2、筛选出一种特异性miRNA-612,采用RT-PCR方法检测组织中特异性表达的miRNA-612,从而验证与基因芯片结果的一致性。3、利用生物信息学分析,筛选出miRNA-612特异性靶基因wt-P53。4、选取ESCC细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室细胞迁移实验及侵袭实验进行miRNA-612的功能验证。5、Egfp荧光素酶报告载体实验验证wt-P53为miRNA-612的特异性靶基因。6、检测wt-P53在正常粘膜组织及ESCC组织中存在差异表达。7、从基因和蛋白水平分别验证miRNA-612和wt-P53在ESCC中存在的靶向关系。材料和方法1、选取10例ESCC新鲜冻存组织及对应的正常食管粘膜组织,采用上海康成生物有限公司代理的Exiqon公司的miRNAs表达谱芯片,Trizol法提取总RNA,采用AxonGenePix4000B芯片扫描仪获取芯片的荧光强度,GenePix pro V6.0软件获取数据并进行原始数据分析,t检验结合Fold Change筛选出差异表达的miRNAs。采用MEV software(v4.6,TIGR)对筛选出的miRNAs进行聚类分析,筛选出和ESCC转移相关的差异表达的基因。2、选择基因表达谱芯片测定中明显上调的特异性miRNA-612,以U6作为内参基因进行校正和标准化,使用RT-PCR方法予以验证与基因芯片的一致性。3、分别统计 TargetScans、Pictar、miRanda 和 MirTarget2 四种生物信息数据库,取四种数据库所预测的交集作为靶基因,进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析和基因功能分类,结合既往对ESCC癌基因的研究统计数据库,筛选出miRNA-612可能的靶基因。4、以人ESCC EC109细胞株进行miRNA-612沉默质粒的转染。使用RT-PCR技术验证各组的转染效率。随后对不同组别的细胞株进行功能验证,包括细胞划痕实验、Transwell小室细胞迁移实验及细胞侵袭实验。5、将表达miRNA-612的质粒pSilencer/miR-612或者对照质粒pSilencer/NC和荧光报告载体pcDNA3-Egfp-P53-3’UTR或者突变后的荧光报告载体质粒 pcDNA3-Egfp-P53-3’UTRmut,采用 LipofeCtamine2000 共转染 EC109细胞。转染后48 h,使用荧光分光光度仪分别检测绿色荧光蛋白表达水平的变化。6、收集2002年4月～2005年2月期间山东大学附属千佛山医院胸外科ESCC根治手术病例,分别选取有淋巴结转移的新鲜冻存标本34例和无淋巴结转移的新鲜冻存标本36例,正常鳞状上皮粘膜组织20例,采用Western blot法分别检测不同组织中wt-P53的蛋白表达。7、将表达 miRNA-612 的质粒 pSilencer/miR-612 及对照质粒 pSileneer/NC分别转染EC109细胞,分别采用RT-PCR方法及Western blot技术在mRNA水平及蛋白水平检测wt-P53的表达情况。结果1、有淋巴结转移组与无淋巴结转移组ESCC患者相比较,差异表达的miRNAs共16个,其中表达上调的miRNAs有9个,表达下调的miRNAs有7个。将这些miRNAs分别进行差异倍数的分析及PAM比较,得到一种与肿瘤转移相关的miRNAs,即在淋巴结转移中表达上调的miRNA-612。2、经RT-PCR验证,与正常粘膜组织相比,ESCC组织中miRNA-612表达上调,且淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,结果与基因芯片一致。3、GO数据库及KEGE数据库分析发现,miRNA-612预测的靶基因,生物学功能涉及的环节很多,包括细胞的生长、分化、凋亡以及转录、信号转导等,从多个方面共同调节肿瘤的发生、发展。我们选择可以促进细胞凋亡与抑制增殖的特异性靶基因wt-P53,blast数据库比对后显示,wt-P53的3’UTR区存在能与miRNA-612 5’端结合的相关序列。4、抑制miRNA-612活性后,在不显著影响细胞增殖的前提下,miRNA-612 inhibitors能够显著降低EC109细胞的侵袭及迁移能力,提示miRNA-612对人ESCC的发展和侵袭、转移可能具有正性调控作用。5、Egfp荧光素酶报告载体实验中,miR-612可以降低P53 3’UTR质粒中绿色荧光蛋白的表达,但对于P53 3’ UTR突变的报告质粒表达的绿色荧光蛋白无明显影响,提示miRNA-612可以作用于P53的3’UTR区,即P53是miRNA-612的靶基因。6、Western blot法检测ESCC组织中wt-P53蛋白的表达水平,ESCC有淋巴结转移组与无淋巴结转移组中wt-P53的表达均明显低于正常粘膜组织(P<0.05),而有淋巴结转移组与无淋巴结转移组相比亦存在显著性差异(P<0.05)。7、将 pSilencer/miRNA-612 转染 EC109 细胞中,采用 RT-PCR 及 Western blot法分别检测wt-P53在mRNAs水平及蛋白水平中的表达,发现miRNA-612可以下调wt-P53的mRNAs和蛋白表达水平,miRNA-612的表达变化与wt-P53基因的表达变化呈负相关(P<0.05)。结论1、经基因芯片联合生物信息学技术分析,筛选出一种与ESCC侵袭、转移相关的特异性mRNAs即miRNA-612。2、miRNA-612对人ESCC细胞的侵袭及迁移能力可能存在正调控作用。3、miRNA-612通过下调wt-P53基因的表达,更加速了肿瘤的侵袭与转移。