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目的:通过体外建立糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)视网膜Müller细胞的病理模型,给予sigma-1受体(sigma-1 receptor,σR1)特异性配体喷他佐辛干预,观察高糖环境下视网膜Müller细胞中表达及分泌胶质源性神经营养因子(Glial derived neurotrophic factor,GDNF)和脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)的变化,探讨喷他佐辛对高糖环境中视网膜Müller细胞表达及分泌GDNF和BDNF的影响,为喷他佐辛对DR Müller细胞的作用机制提供新的理论基础。方法:通过体外分离新生3-5天的SD大鼠乳鼠视网膜细胞,采用组织块培养法,原代培养SD大鼠乳鼠视网膜Müller细胞,8-12天后体外培养的视网膜Müller细胞90%以上融合,按1:2的比例进行传代,传到第3代时,经免疫细胞化学法鉴定,确定所培养的细胞为视网膜Müller细胞后,饥饿处理细胞,同时给予高糖、喷他佐辛药物干预,将实验分4组:正常对照组(葡萄糖浓度为5mmol/L,NC),高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L,G),喷他佐辛组(喷他佐辛浓度为3umol/L,P),高糖+喷他佐辛组(葡萄糖浓度为30mmol/L,喷他佐辛浓度为3umol/L,GP),经喷他佐辛药物干预24h、72h和120h后,分别通过免疫印迹(Westen Blot)法和酶联免疫吸附实验(ELISA)法,测定视网膜Müller细胞内及视网膜Müller细胞培养上清液中GDNF和BDNF的表达水平。应用SPSS17.0软件对所有实验数据进行分析,计数资料采用卡方检验;计量资料采用均数±标准差表示;均数间比较采用单因素方差分析;以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1 视网膜Müller细胞的鉴定:通过免疫细胞化学法鉴定所培养的视网膜细胞为视网膜Müller细胞;2 Westen Blot法测定视网膜Müller细胞内GDNF和BDNF蛋白表达水平:2.1喷他佐辛干预24h、72h和120h后视网膜Müller细胞内GDNF的表达情况:1)高糖干预24h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:0.792±0.010、0.956±0.007、1.073±0.022、1.082±0.022,高糖组与正常组比较,GDNF在视网膜Müller细胞内的表达明显升高(P<0.05)。同一时间点给予喷他佐辛干预后,喷他佐辛组与正常组比较,GDNF的表达水平也升高(P<0.05),而高糖+喷他佐辛组与高糖组比较,GDNF的表达水平无明显差异(P>0.05),高糖+喷他佐辛组与正常组比较,GDNF的表达水平明显升高(P<0.05)。2)喷他佐辛干预72h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:0.507±0.007、0.729±0.002、0.851±0.003、1.094±0.016;干预120h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:0.638±0.003、0.915±0.003、1.127±0.001、1.206±0.027,高糖组、喷他佐辛组和高糖+喷他佐辛组与正常组分别比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较GDNF的表达水平显著升高,均有统计学意义(P<0.05)。2.2喷他佐辛干预24h、72h和120h后视网膜Müller细胞内BDNF的表达情况:1)喷他佐辛干预24h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:1.059±0.006、0.936±0.001、1.051±0.006、0.940±0.004,高糖组与正常组比较,BDNF在视网膜Müller细胞内的表达减少(P<0.05)。高糖+喷他佐辛组与正常组比较,BDNF的表达水平减少(P<0.05)。喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较,BDNF的表达水平均没有明显变化(P>0.05)。2)喷他佐辛干预72h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:0.948±0.029、0.795±0.007、1.111±0.025、0.999±0.014,高糖组与正常组比较,BDNF在高糖组的表达量明显减少(P<0.05),而在同一时间点的喷他佐辛干预后,喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较,BDNF的表达明显升高(P<0.05);干预120h后,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:0.774±0.002、0.629±0.004、0.867±0.001、0.755±0.006,高糖组与正常组比较,BDNF在高糖组的表达水平明显减少(P<0.05),而在同一时间点的喷他佐辛干预后,喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较,BDNF的表达明显升高(P<0.05)。3、ELISA测定视网膜Müller细胞培养基上清液中GDNF和BDNF的表达:1)喷他佐辛干预24h、72h和120h后上清液中GDNF表达水平的比较:干预24h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:2.767±0.279、1.966±0.315、3.096±0.232、2.599±0.305;干预72h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:2.334±0.261、1.674±0.341、2.852±0.419、2.228±0.240;干预120h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为:2.187±0.250、1.443±0.356、2.539±0.321、2.074±0.256。高糖干预24h、72h和120h后,高糖组与正常组比较,上清液中GDNF的表达水平均明显减少(P<0.05)。而在同一时间点给予喷他佐辛干预的各组中,喷他佐辛组与正常组比较、喷他佐辛+高糖组与高糖组比较,发现培养上清液中GDNF的表达显著增加(P<0.01),喷他佐辛+高糖组与正常组比较,培养上清液中GDNF的表达水平没有显著差异(P>0.05)。2)喷他佐辛干预24h、72h和120h后上清液中BDNF表达水平的比较:干预24h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:6.670±0.224、5.114±0.260、6.278±0.137、4.689±0.251;干预72h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:6.172±0.260、4.637±0.256、3.574±0.219、2.597±0.139;干预120h时,正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为:5.433±0.254、3.939±0.250、2.903±0.213、1.951±0.136。高糖干预24h、72h和120h后,高糖组与正常组比较,上清液中BDNF的表达水平均显著减少(P<0.01),而在同一时间点给予喷他佐辛干预后,喷他佐辛组、喷他佐辛+高糖组与正常组比较、喷他佐辛+高糖组与高糖组比较,发现BDNF的表达水平也显著减少(P<0.01)。结论:1 高糖环境下,视网膜Müller细胞表达GDNF水平升高和分泌GDNF水平下降,应用喷他佐辛可上调GDNF的表达和分泌。2 高糖环境下,视网膜Müller细胞表达及分泌BDNF水平明显减少,应用喷他佐辛后可逆转视网膜Müller细胞中BDNF表达减少的现象,但并没有改变视网膜Müller细胞分泌BDNF减少的情况,反而抑制了视网膜Müller细胞对BDNF的分泌。