日本乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是一种由乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的人畜共患的病毒性传染病。主要引起人的神经系统疾病以及猪的繁殖障碍，对养殖业和人类的健康有极大的威胁。猪是本病的扩散宿主，乙脑可以通过蚊虫传染到人类。因此乙脑的诊断和防治不但对于猪的规模化养殖有重要的意义，而且有重要的公共卫生学意义。 本课题主要是乙脑实验室诊断方法的研究和初步应用。主要工作包括以下三个方面： 1．乙脑全病毒酶联免疫吸附试验诊断（ELISA）方法的优化及试剂盒的研制与初步应用 选取9-11日龄的健康鸡胚增殖乙脑病毒SA14-14-2株，经过病毒纯化，提纯的病毒包被ELISA板，选择最佳包被条件，确定阴阳性界限值，建立ELISA诊断方法，在4℃和-20℃两种条件进行保存期试验，实验结果表明，酶标板可以在两种条件下保存12个月而不影响检测结果。将该方法的相关试剂装配组成ELISA试剂盒，并对试剂盒进行了特异性、重复性等相关特性进行研究，结果表明ELISA试剂盒特异性强、敏感性高、重复性好。应用该试剂盒与血凝抑制试验（HI）对85份血清进行同步检测，两者符合率达86.2％。在此基础上，用ELISA试剂盒对127家猪场的1454份血清进行了检测，其中阳性882份，阳性率为60.7％，表明该试剂盒可以在临床上进行血清学的检测和流行病学的调查。 2．乙脑病毒逆转录-聚合酶联反应诊断（RI-PCR）方法的建立和初步应用 通过对乙脑病毒基因组的比较，针对NS1基因中比较保守的一段序列设计了一对引物，扩增出长度为430bp的片段。提取疑似乙脑病例新鲜病料中的RNA，确定适当的扩增条件，扩增NS1的特异性片段，建立了检测乙脑抗原的PCR诊断方法。并对该方法的灵敏性和特异性进行了研究：用不同滴度的乙脑活疫苗提取RNA进行RT-PCR，产物进行二次扩增，然后进行鉴定，结果表明可以检测到5TCID₅₀的病毒量；检测结果表明，该方法灵敏性高、特异性强。在此基础上对送检的38份病料进行了检测，其中检出阳性13份，阳性率为39.5％。试验结果表明，RT-PCR方法是临床检测乙脑病原的一种行之有效的方法，特别是对乙脑早期病例的检测。 3．乙脑病毒E基因表达蛋白ELIsA方法的建立和初步应用 日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用 E基因是乙脑病毒主要抗原基因。采用E基因的表达产物作为包被抗原，替代全病毒作为包被抗原，可以减少操作人员被感染和应用全病毒EUSA试剂盒造成环境污染的风险。本研究通过大肠杆菌表达乙脑病毒主要抗原基因E基因，选择最佳的表达条件，提取、纯化表达蛋白形成的包涵体，用提纯的包涵体包被ELISA板来检测乙脑抗体，确定最佳的包被条件，确定阴阳性界限值，建立了乙脑E蛋白的ELISA诊断方法。用该方法对引起猪繁殖障碍的其它传染病做了检测，检测结果均为阴性;随机抽取了6份不同抗体水平的血清，用不同批次包被的酶标板进行检测，结果变化不大;用该方法和血凝抑制对97份血清进行同步检测，两者符合率为95.8%，比血凝抑制试验阳性率高2.0%，用该方法和全病毒ELISA方法对送检的97份血清进行了同步检测，两者符合率为95.8%;检测结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。用建立的该方法对送检的892份血清进行了检测，其中阳性血清422份，阳性率达47.3%。以上结果说明该方法可以替代全病毒ELISA方法用于流行病学调查和血清学诊断。