论文部分内容阅读
甲氧基丙烯酸酯类(Qo Is)杀菌剂是目前全球第一大杀菌剂类别,具有广谱、高效、低毒、安全、作用机制独特等特点,对半知菌、卵菌、子囊菌、担子菌均表现出良好的生物活性,但由于其对水生生物具有较高的毒性风险,从而限制了其在水田作物上的登记和使用。研究发现,通过构建微囊负载体系可显著降低该类杀菌剂对水生生物的毒性,但目前国内外农药微囊化技术的研发侧重于针对靶标有害生物的药效去优化,而忽视了针对水田环境中非靶标生物的降毒。那么,平衡两者的关系设计出适用于水田的高效低毒的微囊化制剂,实现高效、低毒这一目标是当前农药制剂研发的重大需求。为此,本研究以Qo I类杀菌剂吡唑醚菌酯为模式农药,以斑马鱼为模式生物,在明晰吡唑醚菌酯进入鱼体内的急性致毒途径及致毒靶器官基础上,根据药剂对鱼的致毒特性,研究了不同特征参数负载体系的吡唑醚菌酯微囊在水体中的释放、沉降等环境行为,以及在鱼体致毒过程中与致毒靶器官的互作规律,目的是探明配方及工艺参数对各致毒环节的靶向负调控机制,指导微囊制剂研发。主要结果如下:1.吡唑醚菌酯对斑马鱼的急性致毒途径与致毒靶器官比较了水溶暴露、头部浸药、躯干浸药等三种染毒方式下吡唑醚菌酯对斑马鱼的急性毒性及在鱼体内的富集行为。发现水溶暴露和头部浸药处理后,吡唑醚菌酯进入斑马鱼的富集量以及对鱼的毒性水平显著高于躯干浸药,且两种染毒方式的毒性及富集水平差异不显著,说明药物主要经斑马鱼的头部进入体内,而非鱼体表皮。含毒饲料喂食试验表明吡唑醚菌酯经消化道进入鱼体对鱼的急性毒性较低。因此初步确定吡唑醚菌酯主要经头部的鳃组织进入鱼体内,进而对鱼产生高毒性。为进一步确定吡唑醚菌酯对斑马鱼的急性致毒靶器官,研究了水溶暴露和尾静脉注射处理后,吡唑醚菌酯对斑马鱼鳃组织、心脏和脑组织三个关键器官的病理损伤以及线粒体功能的影响。结果表明,药物经鳃和经尾静脉进入鱼体对斑马鱼的毒性差异不显著,两种染毒方式处理后,鳃组织均出现明显的病理损伤,导致鳃小片基部增生、弯曲严重、并且发生黏连、融合、末端膨大等现象,严重时出现固缩、变短、空腔和肿胀等损伤情况。而心脏和脑组织没有发现明显的病理学变化。另外,药物处理后,鳃组织的膜电位明显下降,而心脏和脑组织的线粒体膜电位没有出现明显的变化。另外,药剂处理后,三个器官中的ATP含量明显减少,但是仅鳃组织和心脏的复合体III活性明显受到抑制,表明吡唑醚菌酯对斑马鱼的心脏和脑组织虽然无明显的病理损伤现象,且线粒体功能正常,但对组织的能量供应存在不同程度的影响。从组织、细胞及生理生化水平综合分析,鳃组织均是受损最严重的器官,初步认定鳃组织是吡唑醚菌酯对鱼类的关键致毒靶器官。2.Qo I类和SDHI类杀菌剂对鱼类的毒性差异与鳃毒性水平呈正相关七种呼吸抑制剂类杀菌剂对斑马鱼的96 h-LC50值为:吡唑醚菌酯(0.048 mg/L)<肟菌酯(0.122 mg/L)<吡唑萘菌胺(0.289 mg/L)<醚菌酯(0.540 mg/L)<噻呋酰胺(0.931 mg/L)<嘧菌酯(1.31 mg/L)<啶酰菌胺(1.74 mg/L),其中,毒性最高的吡唑醚菌酯和毒性最低的啶酰菌胺对斑马鱼的96 h-LC50值相差36.3倍。另外,七种药剂对鱼体鳃组织存在明显的病理损伤作用,且两类杀菌剂对鳃中各自的靶蛋白有明显的抑制活性,抑制率与毒性水平呈正相关关系。通过相关性分析发现,药剂对离体鳃细胞的IC50值与药剂对斑马鱼的96 h-LC50值呈明显的正相关关系,且其相关性明显高于药剂在斑马鱼体内的BCF与96 h-LC50的相关性,表明呼吸抑制剂类杀菌剂对斑马鱼鳃组织的损伤差异是造成其对斑马鱼毒性差异的主要因素,而药剂在鱼体内的富集效率差异是造成毒性差异的次要因素。离体酶活试验以及分子对接评估结果表明,两类药剂与各自靶蛋白结合能力差异造成的对靶标酶的抑制活性差异可能是鳃组织损伤差异的根本原因。综上可得,鳃组织是呼吸抑制剂类杀菌剂对鱼类的共同致毒靶器官,鳃组织的损伤差异是导致呼吸抑制剂类杀菌剂对鱼毒性差异的关键因素,而富集效率的差异是造成药剂选择毒性差异的辅助因素。3.吡唑醚菌酯微囊化靶向负调控对鱼急性毒性的机制比较了三种囊壁材料(聚脲、聚氨酯、环氧树脂)、三种囊壳致密度和三种粒径大小的吡唑醚菌酯微囊在水中的释放行为。环氧树脂微囊的释放速率最快,聚氨酯微囊次之,聚脲微囊的释放速率最慢;而随着微囊尺寸的减小,同一材料的载药微囊与外界环境的接触面积逐渐增加,造成内部的芯材向外界释放有效成分的速率增加;而随着囊壳致密程度的增加,微囊的释放速率也逐渐减缓。通过分析吡唑醚菌酯微囊在水中的释放动力学与对斑马鱼96 h-LC50值关系,确定载药微囊在水中的释放速率与其对鱼的急性静态毒性呈正相关,表明吡唑醚菌酯微囊在水中释放行为是调控毒性的关键因子。另外,不同特征参数的载药微囊在水中的沉降动力学也存在明显差别,其中,粒径越大以及囊芯密度越大的微囊在水中的沉降速率越快。载药微囊对斑马鱼的急性动态毒性试验表明,吡唑醚菌酯微囊对鱼的动态96 h-LC50值明显低于其静态96 h-LC50值,且粒径越大、囊芯密度越大的微囊动-静态毒性差异倍数越高。另外,载药微囊在水中的释放速率与其对鱼的急性动态毒性相关性明显高于其与急性静态毒性的相关性,表明吡唑醚菌酯微囊在水中沉降行为也是影响急性毒性的关键因子。除此之外,载药微囊对斑马鱼的急性毒性水平呈现出明显的空间及时间毒性效应,这从侧面证明沉降行为在调节载药微囊在水环境中的时空风险变化中也发挥着重要的作用。水中的载药微囊经吸入途径富集于鳃组织后,其在鳃组织中的富集及转运效率会影响其对鱼的毒性水平。本研究发现与常规剂型乳油相比,载药微囊可以显著降低药剂在鳃组织的富集和转移效率。另外,对于相同粒径不同壁材的吡唑醚菌酯微囊,释放速率高的载药微囊在鳃组织更易富集和转运;而对于相同壁材的载药微囊,粒径越小、囊壳越软的载药微囊越易被鳃小片拦截和吸附,造成微囊颗粒在鳃组织处的高效率富集,进而引发高毒性。进一步分析吡唑醚菌酯样品在鳃组织中的BCF与TF与对鱼的急性静态96 h-LC50值的关系,发现药剂在鳃组织的富集效率与对鱼的急性毒性相关性(R~2=0.666)显著高于转移效率与毒性水性的相关性(R~2=0.004)。由此推断,调节载药微囊在鳃组织中的富集效率可以调控药剂对水生生物的风险。4.高效、低毒的吡唑醚菌酯微囊制剂的研发采用菌丝生长速率法及盆栽接种试验测定了吡唑醚菌酯微囊样品对水稻稻瘟病菌的生物活性及防治效果。其中,仅Pyr@PUA-S和Pyr@PURD3-S对稻瘟病菌的毒力较低,对稻瘟病的防治效果低于巴斯夫公司的微囊产品“稻清”,其他微囊样品的防治效果均高于或与“稻清”防效相近。利用选择因子进一步评估了通过微囊制剂平衡药效与毒性的潜力。结果表明,常规剂型乳油的药效/毒性的选择性最低,“稻清”的选择性显著高于乳油剂型,而自研的8种载药微囊选择性均高于BASF-MC,仅Pyr@PURD3-S的选择因子与BASF-MC相近,表明本研究所研制的所有载药微囊均具有优良的活性/毒性选择性。综合毒性、防治效果以及选择性评价结果,除防病效果较低的Pyr@PUA-S和Pyr@PURD3-S,其余七种微囊制剂均有希望满足水田农药登记的要求。因此,微囊负载体系的壁材种类、囊壳致密度、囊芯密度、粒径范围等参数均可作为农药微囊对靶标和非靶标生物间的活性/毒性的平衡调控因子。