目的探讨β2m-Linker-HLA A2蛋白和能被HLA A2识别提呈的Melan A短肽（ELAGIGILTV）联合刺激,能否诱导表达Melan A抗原肽特异性TCR（Melan A-specific TCR）的CD8⁺Jurkat细胞的活化,为筛选其他抗原肽特异性CTL提供新的思路及方法。方法1.以HLA A2⁺健康人的PBMC为模板,分别扩增得到β2m-Linker序列及Linker-HLA A2-His tag序列,再通过重叠延伸PCR将二者相连得到β2m-Linker-HLA A2-His tag序列,并克隆至pc DNA3.4载体上。2.将pc DNA3.4/β2m-Linker-HLA A2-His tag重组质粒在Expi293F系统中进行表达,经镍柱亲和层析纯化得到β2m-Linker-HLA A2蛋白。3.采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA验证β2m-Linker-HLA A2蛋白的纯度及性质。4.采用流式细胞术（FCM）验证实验室现有的CD8⁺Jurkat细胞中CD8的表达水平和Melan A-specific TCR CD8⁺Jurkat细胞中Melan A抗原肽特异性TCR的表达水平。5.将联合使用β2m-Linker-HLA A2蛋白与Melan A短肽刺激的Melan A-specific TCR CD8⁺Jurkat细胞设为联合实验组（S-1）,仅使用Melan A短肽刺激组设为实验组（S-2）,无关短肽刺激组（N-1）设为阴性组,组间对照组采用细胞为未转染Melan A-specific TCR的CD8⁺Jurkat细胞,FCM检测各组细胞作用24小时后CD137的表达水平。结果1.经酶切和测序证实pc DNA3.4/β2m-Linker-HLA A2-His tag重组质粒构建成功。2.β2m-Linker-HLA A2在Expi293F表达系统中获得可溶性表达,并经SDS-PAGE检测在分子量40KDa和55KDa中出现单一的蛋白条带,证实该蛋白纯化成功;Western blot检测在40KDa和55KDa之间有特异性条带;间接ELISA结果表明实验组（β2m-Linker-HLA A2蛋白）OD_450nm值和阴性组（无关蛋白）OD_450nm值、空白组（PBS）OD_450nm值相比,具有显著差异（P<0.05）。综合以上实验结果证实所纯化的蛋白就是β2m-Linker-HLA A2。3.应用FITC标记的抗人CD8抗体对CD8⁺Jurkat细胞进行染色,结果表明,该细胞中CD8的表达率为69.7%。应用BV421荧光素标记的Melan A-Tetramer对转染有Melan A-specific TCR的CD8⁺Jurkat细胞（实验室保存）进行染色验证,流式结果显示,该CD8⁺Jurkat细胞表达Melan A抗原肽特异性TCR达84.2%。4.联合实验组（S-1）在作用24h后,能够有效激活Melan A-specific TCR CD8⁺Jurkat细胞,其CD137的表达水平为2.64%。与实验组（S-2）,阴性组（N-1）和组间对照组相比,具有显著性差异（P<0.05）。结论β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A肽段联合作用能有效刺激Melan A-specific TCR CD8⁺Jurkat细胞活化,有利于后续对黑色素瘤肿瘤细胞的杀伤,并为筛选其他抗原肽特异性CTL提供新的思路及方法。