病毒性心肌炎(VIRAL MYOCARDITIS,VMC)是一类由病毒感染引起的以心肌局灶性或弥漫性炎症为主要特征的临床常见心血管系统疾病。VMC临床表现不明显且缺乏针对性诊疗手段,因此其真实发病率被低估。VMC的全球发病率估计在0.12-12%之间,且发病呈上升趋势;我国VMC的发病率为5%-15%不等。VMC已成为青少年猝死的主要原因之一,占心血管类疾病引发的青少年猝死病例的4%-20%。VMC的长久不愈容易进展为心脏纤维化、致死性扩张性心肌病(DILATED CARDIOMYOPATHY,DCM)和心衰。作为影响人类健康的一类重要的心血管类疾病,VMC的发病机制尚未明确,临床缺少有效的诊疗方法。因此,阐明VMC的发病机制具有重要的理论和实践意义。引发VMC的病毒包括肠道病毒、腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒等,其中肠道病毒B3型柯萨奇病毒(COXSACKIEVIRUS B TYPE 3,CVB3)感染引起的VMC占30%左右。CVB3为小核糖病毒科无衣壳正链RNA病毒。经粪口途径感染,入血后通过血液循环进入心脏、胰腺、脑、肝脏、肺、脾脏等,通过柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie-adenovirus receptor,CAR)和辅助受体衰变加速因子(Decay accelerating factor,DAF)感染心肌细胞、胰腺细胞等,导致心肌炎、胰腺炎、肝炎、病毒性脑炎等症状,其中病毒性心肌炎较为显著。CVB3引起的病毒性心肌炎可分为三个阶段:(1)急性病毒期;(2)亚急性免疫期;(3)慢性心肌病期。在急性期(0-3天),CVB3在心肌细胞大量复制,造成心肌直接损伤;在亚急性期(4-10天),病毒感染激活心脏局部固有免疫,导致炎症细胞因子和趋化因子的分泌以及多种免疫细胞的浸润,这一免疫浸润在第7-12天达到高峰,即所谓急性心肌炎(acute VMC);在感染后期,炎症减轻,启动组织修复,但炎症迁延不愈则可能进展至慢性心肌炎和纤维化。由此可见急性VMC有少量病毒直接损伤因素,但主要由心脏局部的免疫细胞浸润带来的免疫炎症损伤所介导。急性VMC期间心脏浸润细胞主要包括:巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞,以及少量B、肥大细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)和NK等。其中巨噬细胞最多,而研究最多的是急性VMC期间Th1和Th17细胞的炎症功能。上述免疫细胞分泌的炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1b和IL-17是致VMC最为相关的细胞因子。以往对VMC的研究重点大多集中于适应性免疫应答,特别是Th1、Th17、Treg等在VMC发病中的作用及机制,而针对感染早期的固有免疫研究较少。固有免疫是机体抗感染的第一道防线,发挥早期非特异抗病原体作用,更重要的是,固有免疫细胞如巨噬细胞和DC表面或胞内的多种模式识别受体(PRRs)通过识别病原体特定的病原相关分子模式(PAMPs),激活固有免疫信号通路,启动促炎因子和I型干扰素(IFNa/b)分泌和抗原提呈相关分子(MHC II和B7)高表达,因此固有免疫对于启动和调控后续T、B适应性免疫应答格局起关键作用。国内外学者陆续报道了感染早期心脏浸润的巨噬细胞、NK、gdT细胞功能以及TLR1-TLR9、RIG-1等PRRs介导的固有免疫炎症作用对于VMC发生的影响。而我们课题组前期致力于巨噬细胞、TLRs固有免疫信号激活及其效应,发现CVB3感染早期心脏局部巨噬细胞M1/M2差异性极化、经由TLR13等固有免疫信号通路所介导的抗病毒作用及促进炎症细胞因子作用,在急性CVB3发病中扮演非常重要的初始作用。提示固有免疫是阐明VMC发生发展机制的重要前沿。在对VMC的致炎细胞因子研究中,IL-17A无疑是最重要和研究最多的明星分子之一。IL-17细胞因子包括IL-17A至IL-17F及其受体等一系列家族分子,是一种在感染和肿瘤等发生早期在局部分泌的炎症细胞因子,发挥局部促炎作用和组织修复等多种功能。2000年前后的若干报道,陆续证实促炎细胞因子IL-17A在VMC发病中发挥必不可少的作用,IL-17A KO小鼠发生VMC的几率和严重程度显著下降,基于IL-17A是CD4+Th17细胞的主要效应分子,推断Th17在VMC发病中扮演重要作用。然而随着免疫学界对于固有免疫的认识的不断深入,以及对于固有免疫细胞及功能亚群的不断发现,科学家发现分泌IL-17A的免疫细胞除Th17,还有多种固有免疫细胞和上皮细胞,其中gdT细胞逐渐被认为是IL-17A的一个重要来源。gdT细胞是取用多样性显著有限的TCRγ和TCRδ链的不同于传统取用α/β链的αβT细胞的隶属固有免疫的T细胞,通常位于人体的皮肤、粘膜局部和腹腔等部位,发挥重要的抗感染和抗肿瘤功能。近期在肿瘤免疫领域,在几种不同的肿瘤如肝癌和肠癌,均报道gdT细胞是肿瘤局部IL-17A的最主要来源,且发挥促进肿瘤生长转移的重要作用。在若干感染模型中,gdT细胞则被认为对于局部招募嗜中性粒细胞、清除局部病原体十分重要。这促使我们对IL-17A在VMC发病中的功能进行重新的深入的认识。通过预实验,我们首先证实了CVB3感染早期(3天),心脏出现gdT细胞的免疫浸润,同时证实该群固有免疫细胞的确分泌高水平的IL-17A,提示我们重新深入研究gdT细胞来源的IL-17A在柯萨奇病毒性心肌炎中的功能和意义具有创新性,有助于纠正过去片面认为只有Th17分泌IL-17A而导致VMC发生的思路。并对未来基于gdT细胞的VMC免疫治疗新策略产生积极的作用。基于以上,我们提出研究的科学假设:作为在急性柯萨奇病毒性心肌炎发病中扮演关键促炎作用的IL-17A,其在心脏局部的来源除了已证实的CD4+Th17外,还有另外一群重要的固有免疫细胞---γδT,且γδT细胞出现在心脏局部的时间早于CD4+Th细胞,则其固有免疫作用特别是分泌IL-17A的作用早于CD4+Th细胞,很可能发挥更为重要的抗感染和促炎作用,可能是解析急性病毒性心肌炎的发病机制的一个新途径和新思路。拟在CVB3感染C57BL/6小鼠的急性心肌炎模型基础上,首先检测心脏局部IL-17A的分泌动力学,通过IL-17A KO小鼠证实IL-17A的关键作用;随后通过流式细胞术在CVB3感染早期(3天)和急性期(7天)检测和确证分泌IL-17A的免疫细胞格局,其中gdT细胞分泌IL-17A的亚群格局;进一步通过TCRdKO小鼠和Vg4中和抗体通过清除gdT细胞,直接证明gdT细胞和分泌IL-17A的Vg4gdT细胞在急性VMC发病中的作用。最后通过检测IL-17A通路下游的趋化因子、嗜中性粒细胞浸润等功能来确认gdT17细胞浸润心脏局部后的多种促炎机制。第一部分IL-17A在急性病毒性心肌炎发病中起关键作用一、CVB3小鼠病毒性心肌炎模型的建立以CVB3感染小鼠建立的VMC动物模型与临床VMC病患特征相似。经剂量摸索,以1~1.5╳103 TCID50的CVB3经腹腔感染C57BL/6雄性小鼠,发现感染后第3天开始小鼠体重明显下降,7天体重下降率达20%;且7天小鼠死亡率为30~60%。第7天小鼠心脏石蜡切片H.E染色显示:正常小鼠心肌细胞完整无炎症,而CVB3感染小鼠心脏内呈炎性细胞浸润和局灶性心肌细胞坏死,提示已成功建立了CVB3感染C57BL/6诱导的急性VMC小鼠模型。二、VMC小鼠心脏内IL-17A分泌的动力学为检测CVB3感染后IL-17A的水平和变化动力学,在CVB3感染后0-7天,ELISA法检测了小鼠心脏和肠道各器官的IL-17A及其他炎症细胞因子的水平。结果发现:未感染时小鼠各器官内检测不到IL-17A,而CVB3感染后IL-17A水平在心脏和肠道均显著增高。同时感染第7天心脏炎症细胞因子TNFa、IL-6、IFNg等水平均显著增高,提示了包括IL-17A在内的炎症细胞因子在心肌炎发病中发挥重要作用。同时CVB3病毒复制水平也在第3天达到高峰。三、IL-17A-/-小鼠在CVB3感染后的心肌炎发病情况为直接证实IL-17A在急性CVB3心肌炎发病中的作用,利用IL-17A KO小鼠,经CVB3感染观察小鼠VMC的发病情况。结果发现:与WT小鼠相比,感染第7天IL-17A-/-小鼠体重减轻显著降低,血清CK-MB水平显著减少,组化显示心脏组织中炎性细胞浸润显著降低。ELISA证实IL-17A-/-小鼠第7天的TNF-α等显著降低,IL-17检测不到;而IFN-γ水平显著增加。病毒复制水平有少量增高。提示IL-17A-/-小鼠感染CVB3后心肌炎显著减轻,IL-17A在急性VMC发病中确实发挥非常关键的促炎作用。第二部分gdT细胞是VMC小鼠心脏局部IL-17A的重要来源一、CVB3感染急性期心脏局部同时存在CD4+Th和gdT细胞浸润已知IL-17A的主要细胞来源包括CD4+Th细胞和gdT细胞。为此,在CVB3感染建立的C57BL/6小鼠急性VMC模型中,于0、3、7天分别检测了两种免疫细胞在小鼠心脏的浸润。流式检测发现:未感染情况下小鼠心脏内几乎没有免疫细胞,而在感染3、7天,心脏组织均可检测到两种免疫细胞的显著增高的浸润。其中:γδT细胞率先进入心脏,在第4天浸润达到高峰,比例达到5.35%,而细胞绝对数达到104,显著高于对照组;而CD4+Th细胞则随时间进展,浸润数目不断增高,于第7天达到高峰,比例达13.4%,数目达106。提示两种免疫细胞均进入心脏组织发挥炎症作用,但动力学有时间差异。二、心脏组织内分泌IL-17A的免疫细胞包括CD4+Th细胞和gdT细胞通过流式细胞术,可将浸润于心脏组织内的免疫细胞进行表型和功能的分类。以IL-17A阳性细胞设门,再分别检测其中的CD4+细胞和gdT细胞比例。发现:CD4+T细胞和γδT细胞均能分泌IL-17A:其中γδT细胞约占60%,而Th17细胞占35%;提示急性VMC发病中心脏浸润的两类免疫细胞均显著分泌IL-17A,其中gdT细胞分泌IL-17A的水平与CD4+Th17相仿或者更高。三、心脏组织内分泌IL-17A的gdT细胞的亚群及其体内动力学在心脏组织第4天达到峰值的浸润γδT细胞中,检测了两个主要的γδT细胞亚群Vγ1和Vγ4的比例和特性,发现:1)急性期(第4天)心脏中γδT细胞亚群Vγ1和Vγ4都有浸润,且比例相当;2)第4天心脏浸润γδT细胞中,分泌IL-17A的主要是Vγ4γδT细胞;3)Vγ4γδT细胞和Vγ1γδT细胞在心脏浸润的动力学相当。综上,小鼠急性VMC过程中,心脏IL-17A的来源除Th17细胞,固有免疫细胞Vγ4γδT细胞也是重要来源,且分泌IL-17A能力略高于CD4+Th17细胞。在感染早期心脏浸润的IL-17A+γδT(Vγ4γδT亚群)细胞可能在VMC发病中扮演非常关键的作用。第三部分:IL-17A+γδT细胞在病毒性心肌炎发病中的作用一、以TCRδKO小鼠证实γδT细胞在VMC发病中的作用首先利用TCRδKO小鼠直接证实γδT细胞在VMC发病中的作用。以CVB3感染TCRδKO小鼠,发现:γδT细胞缺失小鼠VMC发病显著降低,心脏炎症浸润和损伤显著减少;心脏局部炎性细胞因子IL-17A、TNF-α和IL-6水平均显著降低;病毒载量变化不显著。提示gdT细胞在心肌炎发病中发挥重要促炎作用。二、以中和抗体清除IL-17A+Vγ4γδT细胞证实其在VMC发病中的作用利用特异性Vγ4中和抗体于-5、-1天尾静脉注射小鼠两次,清除体内Vγ4γδT细胞,再以CVB3感染检测急性VMC发病。结果显示:1)Vγ4中和抗体清除脾脏和心脏的Vγ4γδT的效率为95%;2)剔除Vγ4γδT细胞后,急性心肌炎显著减轻,CK-MB值显著降低;3)心脏微环境炎症细胞因子IL-17A、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显著降低;4)心脏病毒载量在感染第3天非常显著增加。提示Vγ4T细胞在急性VMC发病中发挥重要的促炎、但抑制毒复制作用。三、过继转输γδT细胞观察γδT来源的IL-17A对VMC的作用。分别体外培养纯度高于60%的正常和IL-17A-/-KO小鼠来源gdT细胞,尾静脉回输TCRδKO小鼠,而后感染CVB3,发现:IL-17A-/-KO小鼠来源gdT细胞输注的小鼠的VMC的发病及心肌炎症显著减少;提示给TCRδKO小鼠补充回复不能分泌IL-17A的γδT细胞,VMC炎症显著减轻。提示γδT在VMC发病中的重要促炎作用通过IL-17A实现。四、分别清除γδT、Vg1、Vγ4γδT和CD4+Th细胞评价CD4+Th17和gdT细胞对VMC心脏炎症的贡献上述研究结果证实Vγ4γδT促进VMC炎症的作用通过IL-17A实现。然而,我们也证实CVB3感染早期gdT与Th17几乎以相似规模浸润于心脏,并同时分泌IL-17A,则如何评估两种IL-17A+T细胞在VMC发病中的作用成为一个重要的但比较困难的科学问题。为此,拟分别以抗gdTCR、Vg1、Vγ4、CD4四种中和抗体清除体内γδT、Vg1、Vγ4和CD4+Th细胞,同期评价CD4+Th17和gdT细胞对VMC心脏炎症的贡献。该实验目前尚在进展中。五、gdT细胞亚群Vg1、Vg4的相互调节作用在VMC发病中的作用已知gdT两个主要亚群Vg1和Vg4可能分泌不同的细胞因子发挥相反的调控作用。而前述已证实CVB3感染早期两种gdT以相似比例同时浸润于心脏,我们发现:1)Vg4主要分泌IL-17A,而Vg1则分泌IFNg,且该能力随CVB3感染0-7天显著增强,接近CD4+Th1。2)通过Vγ1中和抗体清除试验发现使心肌炎加重(结果未显示),提示Vγ1gdT在急性VMC发生中起保护作用。3)发现Vγ4中和抗体清除体内Vγ4γδT细胞后,导致Vg1细胞近2倍的代偿性增高,提示两种gdT亚群可互相调节,后续试验仍在进行中。综上,CVB3感染早期浸润于心脏的γδT细胞在VMC发生中起重要的促炎作用,其Vγ4γδT亚群通过分泌IL-17A促进炎症而发挥有害作用;而Vg1gdT通过分泌IFNg可能调控Vγ4γδT而起保护功能。第四部分:细胞促进CVB3病毒性心肌炎的机制探讨IL-17A可作用于多种细胞表面的IL-17RA受体,发挥多种效应作用。我们考虑心脏显著上调的IL-17A,特别是Vg4gdT17细胞分泌的IL-17A,可能通过调控嗜中性粒细胞的心脏浸润发挥后续的抗病毒和促炎功能。一、gdT17分泌的IL-17A对于靶细胞的趋化因子分泌的上调作用首先检测了IL-17A对心肌细胞和脾脏细胞的趋化因子分泌的调节作用。以IL-17A刺激原代心肌细胞和脾脏细胞,RT-PCR法检测趋化因子的表达,发现:IL-17A作用的原代心肌细胞显著上调CXCL1、CXCL2和CXCL3;而脾脏细胞显著上调CXCL2和CXCL3。随后我们纯化了脾脏中的嗜中粒细胞,拟近期以Transwell检测IL-17A对脾脏嗜中粒细胞的趋化作用检测其表面CXCR2、CXCR5等受体的表达。目前结果提示心脏局部早期浸润的IL-17A+gdT细胞分泌的IL-17A,可促进CXCL1、CXCL2和CXCL3趋化因子分泌,从而招募外周免疫细胞趋化到心脏而加剧急性心肌炎。二、gdT17对嗜中性粒细胞心脏浸润的促进作用IL-17A-IL-17RA通路的另一重要效应是趋化嗜中性粒细胞浸润及功能的激活。我们检测了CVB3感染小鼠心脏嗜中性粒细胞浸润,发现:1)感染第3、7天均可见脾脏和心脏局部的Ly6G+CD11b+嗜中粒细胞浸润显著增加,且感染第3天比例最为显著。2)已纯化脾脏来源嗜中粒细胞,拟进行Transwell实验,预期IL-17A及体外培养的IL-17A+gdT细胞,均可有效趋化脾脏嗜中粒细胞和CD4+Th细胞。三、清除gdT17对嗜中性粒细胞心脏浸润的影响以Vg4中和抗体作用小鼠体内清除IL-17A+Vg4gdT细胞,发现CVB3感染后第3天心脏浸润的嗜中粒细胞显著减少5倍,证实心脏局部早期浸润的IL-17A+gdT细胞分泌的IL-17A,可促进中性粒细胞趋化到心脏发挥免疫炎症作用。后续正在进行心脏浸润的嗜中粒细胞吞噬和促炎功能的研究。综上,在CVB3感染导致的急性病毒性心肌炎发病过程中,本研究创新性提出心脏局部早期浸润的gdT细胞是IL-17A的重要来源,并在VMC发病中发挥关键作用。我们通过多种KO小鼠和中和抗体清除试验,证实CVB3感染7天的急性VMC过程中,gdT细胞和CD4+Th细胞均浸润进入心脏,分别在第3、7天达到高峰;两群细胞均分泌IL-17A,但Vg4gdT细胞早于CD4+Th17细胞进入心脏,且分泌IL-17A的能力高于Th17;体内清除gdT或者Vg4 gdT细胞均可显著减轻急性心肌炎和心脏炎症细胞因子水平;gdT细胞的另一个亚群Vg1gdT细胞同时浸润于心脏,但通过分泌IFNg对Vg4gdT细胞发挥调控作用。CD4+Th17细胞和Vg4 gdT细胞作为CVB3感染后心脏局部分泌IL-17A的主要细胞亚群,共同促进了急性VMC的发生。IL-17+Vg4 gdT细胞促进心肌炎的细胞与分子机制与其上调心肌细胞分泌趋化因子CXCL1/2/3从而促进嗜中性粒细胞浸润心脏相关。我们的研究创新性地发现了IL-17A+Vg4gdT细胞(gdT17)在急性VMC发生中扮演重要促炎作用,并初步阐明其效应与IL-17A-IL-17R通路介导的嗜中粒细胞心脏浸润相关。上述结果为病毒性心肌炎的免疫发病机制的阐明提供了新的基于固有免疫T细胞的思路。