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蜂蛹是蜂的幼虫和蛹,含有丰富的营养物质,其中主要包括蛋白质、脂肪和微量元素。蜂蛹蛋白具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等生物活性,但目前国内对蜂蛹只进行简单的生产加工,绝大多数的蜂蛹资源未得到有效地开发利用,造成蜂蛹资源的浪费,对蜂蛹多肽的制备、纯化及其生物活性的研究较少。本课题组前期对蜂蛹多肽进行了初步研究,表明其纯化组分有较好的抗氧化活性,值得进一步研究。本文将在前期工作基础上,利用碱性蛋白酶对蜂蛹蛋白进行酶法水解制备蜂蛹多肽,并采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子层析法和Sephadex G-25凝胶柱层析法对蜂蛹多肽进行分离纯化,得到两种多肽纯化组分BPP-21和BPP-22,并对这两种纯化组分进行初步表征;以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,研究蜂蛹多肽纯化组分的体外免疫调节活性及其调节机制;采用环磷酰胺致免疫抑制小鼠模型,研究蜂蛹多肽纯化组分的体内免疫调节活性,该研究可为蜂蛹多肽功能食品的研究与开发提供基础,为蜂蛹资源的综合利用提供新途径。主要研究内容如下:(1)蜂蛹多肽的制备、纯化和初步表征。采用酶解法制备蜂蛹多肽,选用碱性蛋白酶水解蜂蛹蛋白得到蜂蛹多肽;采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子层析柱进行纯化,得到4个蜂蛹多肽纯化组分,分别为BPP-1、BPP-2、BPP-3和BPP-4,得率分别为2.3%、6.8%、3.5%和3.2%;采用Sephadex G-25凝胶柱对得率较高的BPP-2进一步分离纯化,得到2个纯化组分BPP-21和BPP-22,得率分别为38.43%和45.62%;Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,BPP-21和BPP-22均为单一条带,分子量均在1000 Da左右;氨基酸分析结果表明,BPP-21和BPP-22分别含有16和14种氨基酸,其中BPP-21和BPP-22中分别含有7种和6种人体必须氨基酸,两者中皆是赖氨酸含量最高,具有较高的营养价值。(2)采用RAW264.7巨噬细胞为研究对象,研究蜂蛹多肽纯化组分BPP-21和BPP-22的体外免疫调节作用及其机制。结果显示:BPP-21和BPP-22在12.5-200μg/mL试验浓度范围内对RAW264.7细胞无明显抑制活性;BPP-21和BPP-22可显著提高巨噬细胞的吞噬能力;显著提高细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和一氧化氮(NO)的分泌量和细胞内IL-2、TNF-α、IFN-γ和iNOs mRNA的表达量;BPP-21和BPP-22可刺激巨噬细胞产生活性氧(ROS),不同程度提高巨噬细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活力,且对细胞无明显氧化损伤作用。免疫调节机制研究显示,BPP-21和BPP-22可通过上调细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p38的磷酸化水平,以及促进其转录因子EIK-1、CREB和MEF2的蛋白表达水平。研究表明BPP-21和BPP-22可通过激活RAW264.7细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路,从而增强RAW264.7细胞的免疫活性。(3)采用环磷酰胺(CTX)致免疫抑制小鼠模型,研究蜂蛹多肽纯化组分BPP-22(25、50和100 mg/kg)对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。结果表明,蜂蛹多肽纯化组分BPP-22中、高剂量组能显著减缓CTX导致的小鼠体重下降趋势,提高小鼠体重增长率;BPP-22中、高剂量组可显著提高免疫抑制小鼠的脾脏和胸腺指数、显著提高免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能,并促进免疫抑制小鼠的细胞因子(IL-2、IFN-γ)和血清免疫球蛋白(IgA、IgM和IgG)的分泌;在高剂量下,BPP-22可显著提高免疫抑制小鼠的耳朵肿胀度,显著增加免疫小鼠的白细胞、淋巴细胞和红细胞数。表明BPP-22可增强环磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫活性。