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研究背景:卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤,虽然近年来临床广泛开展的肿瘤细胞减灭术,结合铂类为基础的联合化疗方案,使卵巢癌的治疗效果显著提高,但多数患者在治疗后2~3年内复发并对以铂类为基础的联合化疗方案产生耐药,使得患者5年生存率仅为40%。因此,明确肿瘤细胞对铂类药物耐药的机制显得尤为重要。自噬(autophagy)是一种将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。肿瘤细胞可以利用自噬来维持细胞生长,从而抵抗化疗药物。硫氧还蛋白相关蛋白14(Thioredoxin-related protein of 14 kDa,TRP14)是2004年发现的一种二硫还原酶,在多种组织中广泛表达,可参与调控肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)信号途径和细胞自噬。然而,TRP14是否可以通过调控自噬参与卵巢癌细胞铂类耐药的机制尚不明确。研究目的:本研究旨在明确TRP14在卵巢癌组织中的表达情况及其与自噬调控蛋白Beclin 1表达水平的相关性,探讨自噬在卵巢癌细胞铂类耐药机制中的作用,阐明TRP14在自噬调控卵巢癌细胞铂类耐药中的作用及分子机制,进而为TRP14和Beclin 1作为卵巢癌患者化疗反应和预后的检测因子提供理论基础,为TRP14作为铂类耐药卵巢癌的潜在治疗靶标提供实验依据。研究方法:1.TRP14和Beclin l在卵巢癌组织中的表达及其相关性应用Oncomine数据库检测TRP14 mRNA在卵巢癌组织中的表达;应用Kaplan-Meier-Plotter数据库分别检测TRP14 mRNA和自噬调控蛋白Beclin 1 mRNA在卵巢癌组织中的表达,以及与卵巢癌预后的相关性和卵巢癌化疗耐药的相关性;应用免疫组织化学染色的方法检测TRP14蛋白和Beclin 1蛋白在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达,并分析二者表达的相关性。2.自噬对卵巢癌细胞铂类药物耐药的影响体外培养卵巢癌细胞亲本株SKOV3、A2780和卵巢癌细胞铂类耐药株SKOV3/DDP、A2780/DDP,通过CCK-8实验检测SKOV3/DDP和A2780/DDP对铂类药物的耐药性;采用蛋白免疫印迹的方法,检测细胞中自噬相关蛋白的表达;利用MDC染色,通过激光共聚焦荧光显微镜观察细胞中自噬小泡的形成;向细胞内转染RFP-LC3质粒构建RFP-LC3细胞模型,利用激光共聚焦荧光显微镜观察并统计细胞中阳性小泡的数量;利用透射电镜技术,观察细胞内自噬体的超微结构。通过以上实验,评价铂类耐药的卵巢癌细胞的自噬水平。自噬抑制剂3MA处理SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞后,以蛋白免疫印迹方法检测自噬相关蛋白的表达;通过CCK-8实验检测细胞对铂类的耐药性;以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中ATG5的表达,利用CCK-8实验分析SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞铂类耐药性的变化;使用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)作用于SKOV3和A2780细胞,采用蛋白免疫印迹方法检测自噬相关蛋白的表达;MDC染色观察自噬小泡的形成;通过激光共聚焦荧光显微镜观察转染RFP-LC3质粒后阳性小泡的数量;透射电镜观察自噬体的超微结构;CCK-8实验检测细胞的耐药性。通过以上实验,评价自噬对卵巢癌细胞铂类耐药性的影响。3.TRP14对自噬的调控作用及其对卵巢癌细胞铂类耐药的影响体外培养卵巢癌细胞亲本株SKOV3、A2780和卵巢癌细胞铂类药物耐药株SKOV3/DDP、A2780/DDP,利用蛋白免疫印迹的方法检测细胞中TRP14蛋白的表达;分别以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中TRP14的表达,以转染pcDNA3.1(+)-TRP14过表达质粒的方法上调SKOV3和A2780细胞中TRP14的表达,采用蛋白免疫印迹方法检测细胞中自噬相关蛋白的表达;以MDC染色方法观察细胞内自噬小泡的生成;利用激光共聚焦荧光显微镜观察转染RFP-LC3质粒后阳性小泡的数量;通过透射电镜观察自噬体的超微结构。通过以上实验,分别评价TRP14对卵巢癌亲本株及耐药株细胞自噬水平的影响。在SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中下调TRP14表达后,利用CCK-8实验检测耐药细胞株对铂类药物的敏感性;以自噬激活剂RAPA处理TRP14表达下调的SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞,CCK-8实验检测耐药细胞株对铂类药物的敏感性;过表达TRP14后,CCK-8实验检测铂类药物对SKOV3和A2780细胞活力的影响;在过表达TRP14的亲本株细胞中,基因沉默自噬调控蛋白ATG5,利用CCK-8实验检测细胞对铂类药物的耐药性。通过以上实验,明确TRP14调控的自噬对卵巢癌细胞铂类耐药的影响。利用蛋白免疫印迹的方法,检测SKOV3/DDP与A2780/DDP细胞中AMPK、mTOR和P70S6K的表达及磷酸化水平;分别以质粒转染的方法上调SKOV3与A2780细胞中TRP14的表达,以基因沉默的方法下调SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中TRP14的表达,检测TRP14对AMPK、mTOR和P70S6K表达及磷酸化水平的影响;使用AMPK抑制剂Compound C处理SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞后,CCK-8实验检测铂类药物对细胞活力的影响。通过以上实验,探讨TRP14调控自噬来影响卵巢癌细胞铂类药物耐药的分子机制。实验结果:1.TRP14和Beclin l在卵巢癌组织中的表达及其相关性生物信息学分析结果显示,与正常卵巢组织相比,TRP14 mRNA在多种亚型的卵巢癌组织中均表达上调。TRP14与Beclin 1的mRNA水平与卵巢癌患者的生存期呈负相关。免疫组织化学染色结果发现,与癌旁组织相比,TRP14与Beclin 1蛋白在卵巢癌组织中均表达上调,且两者的表达水平呈正相关。2.自噬对卵巢癌细胞铂类药物耐药的影响以相同剂量的顺铂处理后,与亲本株细胞SKOV3和A2780相比,耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP的细胞活力明显增加,细胞内自噬调控蛋白Beclin1、LC3 II和ATG5蛋白表达量明显上调,自噬小泡与RFP-LC3阳性小泡的数量显著增多,自噬体及自噬溶酶体结构清晰可见。该结果提示耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP中自噬水平增高。为了验证以上结果,本研究采用自噬抑制剂3MA处理耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP后,自噬相关蛋白Beclin 1、LC3 II和ATG5蛋白表达均明显下调,且细胞对铂类药物的敏感性增加。基因沉默自噬调控蛋白ATG5后,耐药株细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP对铂类药物的敏感性明显上升。以自噬激活剂RAPA干预后,亲本株SKOV3和A2780细胞发生自噬,并且降低了对铂类药物的敏感性。上述实验结果表明自噬是卵巢癌细胞对铂类药物产生耐药的重要机制之一。3.TRP14对自噬的调控作用及其对卵巢癌细胞铂类耐药的影响与亲本株SKOV3和A2780细胞相比,铂类耐药细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP中TRP14蛋白的表达明显上调,提示TRP14可能参与卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的调节。基因沉默TRP14蛋白的表达后,耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中自噬调控蛋白Beclin 1、LC3 II和ATG5的表达明显下调,自噬小泡和RFP-LC3阳性小泡数量显著减少,细胞内自噬体及自噬溶酶体结构减少。过表达TRP14蛋白后,亲本株SKOV3和A2780细胞中自噬调控蛋白Beclin1、LC3 II和ATG5表达明显上调,自噬小泡和RFP-LC3阳性小泡的数量显著增多,细胞内自噬体及自噬溶酶体结构增多。以上结果提示TRP14参与了卵巢癌细胞中自噬的调控。基因沉默TRP14后,耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞对铂类的敏感性增加,且这一过程可被自噬激活剂RAPA所逆转。过表达TRP14后,亲本株SKOV3和A2780细胞对铂类干预的敏感性下降,且这一效应可被ATG5基因沉默所逆转。以上结果提示TRP14是自噬调控卵巢癌细胞耐药性的关键蛋白之一。通过蛋白免疫印迹检测发现,与亲本株SKOV3与A2780相比,耐药株SKOV3/DDP与A2780/DDP细胞中AMPK的磷酸化水平上调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平下调。在亲本株SKOV3和A2780细胞中过表达TRP14后,AMPK的磷酸化水平上调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平下调。在耐药株SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞中基因沉默TRP14的表达后,AMPK磷酸化水平下调,mTOR和P70S6K的磷酸化水平上调。上述结果提示TRP14通过AMPK/mTOR/P70S6K信号通路诱导自噬,从而增加了卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。结论:1.TRP14在卵巢癌组织中高表达,其表达水平与Beclin l蛋白的表达呈正相关,与患者的生存期呈负相关。2.铂类药物可促进卵巢癌细胞发生自噬,从而诱导卵巢癌细胞对铂类耐药。3.TRP14可以改变卵巢癌细胞的自噬水平,进而影响卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。4.TRP14通过AMPK/mTOR/P70S6K信号通路调控自噬,进而影响卵巢癌细胞对铂类药物的耐药性。