目的动脉粥样硬化引起的急性冠状动脉综合症已经成为严重影响我国中老年人健康的常见疾病,并有逐年递增趋势,但由于其发病机制尚不清楚对其防治带来困难。近年来研究认为动脉粥样硬化是一种自身免疫病,多种免疫细胞(巨噬细胞、T细胞)和细胞因子参与了疾病的发生和发展,特别是CD4~+T细胞在动脉粥样硬化中的作用引起了关注。CD4~+T细胞是一类异源性群体,受抗原刺激后在不同的细胞因子作用下可分化为不同的亚群,包括传统的Th1和Th2,以及新近发现的Th17细胞和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)。目前,不同CD4~+T细胞亚群在动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。有资料显示Th1具有促进斑块形成的作用,Th2在斑块形成中的作用尚存在争议。近年来,有两个研究小组认为CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞在动脉粥样硬化的形成中起到保护性的作用,但Th17在动脉粥硬化斑块中的作用尚不清楚。Th17是以分泌IL-17为主要特征的CD4~+T细胞群体,在体外,CD4~+初始T细胞受抗原刺激后在IL-6和TGF-β的作用下可以促使Th0分化成为Th17细胞,控制其分化的转录因子是RORγt。目前研究发现Th17细胞在多种自身免疫性疾病中发挥重要的促进作用,例如:类风湿性关节炎(RA)和自身反应性脑脊髓炎(EAE),动脉粥样硬化是动脉血管壁的自身免疫性疾病,Th17细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中究竟发挥什么样的作用,目前尚不清楚。为了明确T细胞亚群与动脉粥样硬化发生、发展的关系,以及Th17细胞亚群对动脉粥样硬化形成的影响,本论文从以下四个方面进行了研究:一、动脉粥样硬化斑块模型的建立及斑块的形成过程;二、动脉粥样硬化斑块的形成发生过程中不同Th亚群的变化;三、动脉粥样硬化斑块的形成发生过程中相关细胞因子和转录因子的变化;四、Th17/IL-17在动脉粥样硬化形成中的确切作用。方法一、动脉粥样硬化小鼠模型的建立1.ApoE-/-小鼠8周开始给予高脂饲料喂养,10周行左侧颈动脉套管缩窄手术(加速斑块的形成),然后继续高脂喂养分别至16和24周。2.取不同周龄小鼠左侧颈动脉制备连续冰冻切片,HE染色和油红O染色检测不同周龄小鼠颈动脉斑块形成情况和斑块局部脂质沉积情况。3.RT-PCR检测斑块局部相关炎性因子的表达情况。二、动脉粥样硬化的发生过程中Th1,Th17和Treg细胞的变化规律1.分别取未形成动脉粥样硬化斑块、动脉粥样硬化斑块早期和晚期小鼠的脾脏制备脾细胞悬液,进行多种标记。2.流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1,Th17和Treg细胞的比例变化。三、斑块局部相关炎性因子和转录因子的检测1.分别取未形成动脉粥样硬化斑块、动脉粥样硬化斑块早期和晚期小鼠的颈动脉和主动脉弓。2.RT-PCR检测小鼠动脉粥样硬化斑块局部相关炎性因子(IFN-γ、IL-17)和转录因子(T-bet、RORγt)的表达情况。四、IL-17产生细胞对动脉粥样硬化斑块形成的影响1.ApoE-/-小鼠20只,随机分成两组,8周开始给予高脂饲料喂养,10周行左侧颈动脉套管缩窄手术。2.套管5天后给ApoE-/-小鼠腹腔注射中和性IL-17抗体,对照组同时腹腔注射同型对照。3.微型活体超声检测颈动脉形成的斑块大小。4.取小鼠左侧颈动脉制备连续冰冻切片,HE染色和油红O染色检测小鼠颈动脉斑块的大小。结果一、动脉粥样硬化斑块模型的建立及斑块的形成过程(一)颈动脉动脉粥样硬化斑块的形成为了研究不同T细胞亚群在粥样硬化斑块形成中的作用,我们首先利用ApoE-/-小鼠建立了快速颈动脉粥样硬化斑块模型。ApoE-/-小鼠从8周开始给予高脂饲料喂养,10周给予颈动脉套管加速斑块的形成,至小鼠16周和24周后,处死小鼠取颈动脉制备冰冻切片并进行HE染色和油红O染色。结果发现,ApoE-/-模型小鼠8周时,血管壁仅出现增厚但没有斑块的形成;到达16周时,血管内膜有明显的斑块形成,此时,斑块纤维帽较厚,浸润的细胞较多,平滑肌细胞明显增多,含有大量的胶原成分和脂质,属于纤维斑块期,即早期斑块;到达24周时,斑块的纤维帽明显变薄,胶原和平滑肌细胞减少,脂质含量明显增多,为粥样斑块期,即晚期斑块。同龄的野生型C57BL/6细胞在整个观察过程中没有斑块形成。(二)斑块局部粘附分子和细胞因子的变化为了证实斑块中有炎性免疫反应的存在,我们用RT-PCR的方法检测了已经形成斑块的主动脉弓和颈动脉中相关粘附分子和炎性细胞因子的表达情况,结果发现血管粘附分子-1(VCAM-1)以及IL-12和TNF-α在斑块形成后表达明显升高。二、动脉粥样硬化斑块的形成发生过程中不同Th亚群的变化(一)调节性T细胞(Tregs)在斑块形成过程中的变化为了研究调节性T细胞随动脉粥样硬化斑块形成的变化规律,我们采用流式细胞术检测了8周、16周、24周小鼠脾细胞中调节性T细胞的比例,结果发现CD4~+Foxp3~+T细胞从未形成斑块到形成斑块的整个过程中均高于对照组,其中主要是CD4~+Foxp3~+CD25~-T细胞亚群升高,而CD4~+Foxp3~+CD25~+T细胞无明显的变化。此外,我们还发现无论是ApoE-/-模型小鼠还是C57BL/6正常小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞的比例均随年龄的增长呈现下降的趋势,而CD4~+CD25~-Foxp3~+T细胞的比例呈明显上升的趋势。提示这两群调节性T细胞亚群在动脉粥样硬化和衰老中扮演着不同角色,但具体作用有待进一步研究(已经获得国家自然基金资助)(二) Th1和Th17细胞在斑块形成过程中的变化为了研究Th17细胞在动脉粥样斑块形成过程中的作用以及与Th1细胞的关系,我们分别取无斑块(8周)、早期斑块(16周)和晚期斑块(24周)小鼠的脾脏制备脾细胞悬液,采用胞内流式细胞染色方法检测Th1(CD4~+IFN-γ~+T)细胞和Th17(CD4~+IL-17~+T)细胞的数量,结果发现在无斑块形成时,Th1和Th17数量较同龄的野生型小鼠无明显改变,当小鼠有斑块形成时(16周和24周),Th1和Th17细胞的比例较对照组均明显升高,且与斑块的大小呈正比,提示Th17细胞与Th1细胞均参与动脉粥样斑块的形成。三、动脉粥样硬化斑块的形成过程中相关细胞因子和转录因子的变化为了进一步证实Th1和Th17细胞确实存在在动脉粥样硬化斑块局部发挥作用,分别取无斑块(8周)、早期斑块(16周)和晚期斑块(24周)小鼠的颈动脉和主动脉弓部抽提RNA,采用RT-PCR的方法检测RORγt、T-bet和IFN-γ、IL-17在斑块中的表达情况,结果发现相应的转录因子在斑块形成早期和晚期的表达均较对照组明显升高;另外,在ApoE-/-小鼠16周时IFN-γ和IL-17的表达均明显上调,而在斑块形成的晚期则表达降低,进一步证实了Th1和Th17细胞均参与了动脉粥样硬化的发生。四、Th17/IL-17在动脉粥样硬化形成中的确切作用IL-17是Th17细胞的主要效应分子,为了证实Th17细胞在动脉粥样硬化斑块形成中的作用,我们给ApoE-/-模型小鼠腹腔注射抗IL-17的中和性抗体用以中和IL-17的作用,进一步采用小鼠微超声成像和病理学方法观察抗体干预对斑块形成的影响。结果发现9只对照组小鼠左侧颈动脉均有较大斑块的形成,而小鼠体内注射中和性IL-17抗体组,10只小鼠中仅有一只出现了较小的斑块,其他小鼠几乎没有斑块的形成,这就说明产生IL-17的Th17细胞具有促进动脉粥样硬化斑块形成的作用,以此为靶点进行干预对动脉粥样硬化经治疗有重要价值。结论1.不同Th亚群在动脉斑块的形成过程中均发生了改变(1) CD4~+Foxp3~+调节性T细胞(Tregs)在斑块形成过程中比例上调,其中主要是CD4~+Foxp3~+ CD25~-T细胞亚群升高,而CD4~+Foxp3~+CD25~+T细胞无明显的变化,提出CD4~+Foxp3~+CD25~-T细胞亚群可能具有正向调节作用,但具体作用有待进一步研究。(已经获得国家自然基金资助)(2) Th1和Th17细胞在斑块形成后明显升高,且与动脉粥样硬化斑块的大小成正比,另外,斑块局部Th1和Th17相关的转录因子和细胞因子升高,提示Th17和Th1细胞均参与了动脉粥样硬化的形成。2.用中和抗体阻断Th17的主要效应分子IL-17的作用可明显抑制斑块的形成,证明Th17具有促进动脉粥样硬化斑块形成的作用。创新性和意义1.本研究的创新点在于观察了随斑块形成T细胞亚群的变化规律,发现了在斑块形成的早期Th1和Th17细胞即有升高的现象,通过体内试验首先发现了IL-17的主要产生细胞Th17具有促进动脉粥样硬化斑块的形成,为进一步的研究动脉粥样硬化早期的形成机制提供了新的视点,并为以Th17/IL-17作为靶点应用于临床治疗提供了第一手资料。2.调节性T细胞在斑块形成过程中也有明显的变化,并发现了一群CD4~+CD25~-Foxp3~+T细胞的上调,这为研究调节性T细胞在动脉粥样硬化疾病中的作用提出了新的问题。研究的局限性1.鉴于用小鼠做动脉粥样硬化疾病模型,颈动脉形成的斑块较小,使得进一步进行局部研究受到一定的限制。