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姜黄素是姜科和天南星科等植物根茎中的一种化学成分。近年的研究表明姜黄素在体外和动物模型上都表现出多种令人关注的药理特性,包括抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、抗菌、抗病毒等。但是目前对于姜黄素诱导癌细胞凋亡的分子机制并不十分清楚。Akt又称为蛋白激酶B (protein kinase B, PKB)通过Thr308和Ser473位点的磷酸化而活化。FoxO转录因子家族位于细胞核内是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt通路的下游靶点,调控与细胞周期阻滞和细胞凋亡相关的基因转录,如p27和Bim。但是活化的Akt能够使FoxO磷酸化后出核,从而使其失去调控转录的活性。本研究以三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468为细胞模型来研究Akt-FoxO1通路在姜黄素诱导的乳腺癌细胞凋亡过程中的作用,从而探讨姜黄素诱导癌细胞凋亡的分子机制。1.姜黄素对MDA-MB-468细胞活性的影响采用MTT法检测姜黄素对MDA-MB-468细胞活性的影响,结果表明细胞活性随姜黄素浓度上升而降低,呈现明显的浓度依赖,姜黄素在MDA-MB-468细胞上的半数抑制率(IC50)为41.6μM。用0、10、20、30和40μM的姜黄素处理MDA-MB-468细胞,培养24h后,Annexin-V和PI双染,流式细胞仪检测,结果显示细胞凋亡呈药物剂量依赖性,随着姜黄素浓度的提高,晚期凋亡细胞增多,以上结果表明,姜黄素确实可以抑制细胞活性并诱导细胞凋亡。2.姜黄素对MDA-MB-468细胞中FoxO1、Akt、P-Akt、p27的表达的影响FoxO1作为转录因子,在细胞核内调控多种与细胞周期阻滞及凋亡相关的蛋白的表达,如p27。但是P-Akt可以使FoxO1磷酸化出核,从而失去其调控转录的活性。为了探讨Akt-FoxO1通路在姜黄素介导的MDA-MB-468细胞凋亡过程中的作用,实验中我们采用Q-PCR和Western blot方法检测FoxO1在mRNA和蛋白水平上的变化,同时还分别检测了Akt、P-Akt和p27的水平变化。结果显示姜黄素处理后,导致MDA-MB-468细胞中FoxO1在：mRNA及蛋白水平上表达量增加,Akt的活化形式P-Akt水平下调,同时p27上调。3.姜黄素对FoxO1核内外分布的影响FoxO1是P-Akt的下游靶点,可以使FoxO1磷酸化出核。为了探讨姜黄素处理后FoxO1在胞内分布的变化,在实验中通过Western blot分别检测FoxO1在细胞核和细胞浆中的相对含量。结果表明姜黄素降低胞浆内的P-FoxO1的含量,提高核内的FoxO1水平。4. P-Akt抑制剂和姜黄素共同处理对MDA-MB-468细胞中P-Akt、P-FoxO1和FoxO1的影响为了确定姜黄素诱导的P-FoxO1的减少是否由P-Akt介导的,我们用P-Akt的抑制剂Wortmannin和姜黄素共处理MDA-MB-468细胞。结果发现,Wortmannin单独处理组P-Akt和P-FoxO1均下调,和姜黄素单独处理组类似。Wortmannin和姜黄素共处理组P-Akt和P-FoxO1下调增加明显,比单独处理组效果显著。同时,我们检测了FoxO1的表达,结果显示：Wortmannin对FoxO1的表达没有影响,姜黄素单独处理时却可以增加FoxO1的表达量。以上结果表明姜黄素不仅通过下调P-Akt来减少P-FoxO1的含量从而减少FoxO1出核,还能通过增加FoxO1的表达量来增加核内FoxO1的含量。