亚洲棉短纤维发育突变体蛋白质差异分析

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棉纤维分化、发育的过程是其产量和品质的形成过程,对该过程的研究有助于我们通过遗传工程途径人为控制棉纤维的生长发育,以提高棉纤维的产量和品质,因此具有重要的应用及理论意义。而蛋白质是生理功能的执行者,包含了多个维度的生物学信息,蛋白质本身的复杂性使基因组学不能准确的预测其结构和动力学,需要对细胞生长过程中蛋白质的定位、结构和功能进行直接的分析研究。本研究利用两种常见的植物蛋白质提取方法三氯乙酸-丙酮法和饱和酚法提取了棉花胚珠全蛋白,并对提取效果进行了比较分析。我们发现使用三氯乙酸-丙酮法,容易使蛋白酶失活,潜在的蛋白种类更加丰富,但粗蛋白难以溶解,杂质含量较高,不易获得高浓度的蛋白质溶液,产率较低。而利用饱和酚法获得的蛋白质溶液含量和纯度高,操作简单,同时获得的蛋白质种类相对于三氯乙酸-丙酮法更多,等电点分布更广,因此更适宜于含干扰物质较多的棉花胚珠蛋白质的提取。利用饱和酚法对四倍体棉种和二倍体棉种进行了全蛋白的提取,通过对粗蛋白产率的比较分析,我们发现在相同发育时期两棉种总蛋白含量十分接近,而且含量变化曲线也非常相似。利用SDS凝胶电泳获得的图谱可知,除一些高丰度的组成型蛋白外,图谱差异还是比较明显,反映出了不同的遗传背景,可以作为区分棉种的特征之一;由于SDS-PAGE分辨率的限制,棉纤维突变体和野生型中没有发现明显的差异蛋白,对于蛋白质组的分析无法提供足够的信息。通过一系列田间表型及农艺性状的比较分析,我们确定亚洲棉DPL971及其突变体DPL972二者在表型上非常的接近。除在植株色素的表达方面有所不同外,最大的差别体现在短纤维的有无。随后我们利用体式显微镜、扫描电镜及石蜡切片技术对不同时期胚珠表皮细胞进行了细微观察分析,最终确定亚洲棉DPL971短纤维起始的时间在开花后五天左右。我们通过蛋白提取、二维电泳凝胶图谱的制备、蛋白点群的构建、凝胶图谱的评估,对开花后5天DPL971和DPL972棉花胚珠蛋白质组进行了比较分析,经过统计学和人工观测的筛选,共找到差异点59个,其中野生型包含特有点5个、优势点14个,突变体包含特有点14个、优势点26个。这些蛋白点是经过了科学严格的筛选,稳定可靠、重复性好,能够真实的反映出野生型和突变体的差异。同时我们猜测,短绒的起始主要与一些负调控机制有关。本实验结果为我们进一步利用差异表达蛋白克隆功能基因,揭示植物细胞分化起始的复杂机制提供了依据。
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