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研究目的:探讨姜黄素(Curcumin)在IL-1b诱导骨关节炎(Osteoarthritis,OA)中抑制Ⅱ型胶原、促进MMIP-13的调控作用及其可能机制,明确姜黄素在骨关节炎治疗的作用及其相关机制。研究方法:1、软骨细胞的分离、培养及鉴定。2、IL-1b对软骨细胞Ⅱ型胶原、MMP-13表达的影响。IL-1b刺激软骨细胞(17)(19)h,RT-qPCR和Western Blotting技术检测Ⅱ型胶原(type II collagen,COL2A1)及基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)mRNA及蛋白表达水平。3、姜黄素对IL-1b下调Ⅱ型胶原、上调MMP-13表达的影响。予以50mM浓度的姜黄素干预IL-1b刺激的软骨细胞,Western Blotting检测不同时间点Ⅱ型胶原及MMP-13蛋白的表达水平;然后以不同浓度的姜黄素干预大鼠软骨细胞,培养48 h后再次观察Ⅱ型胶原及MMP-13蛋白的表达水平,确定细胞实验中姜黄素干预效用最佳的时间及浓度。4、姜黄素对IL-1b刺激的软骨细胞增殖活性的影响。给予IL-1b预刺激24 h后,分为空白对照组、Curcumin组、PDTC组和Curcumin(10)PDTC组,药物不同时间点干预软骨细胞,CCK8检测比较四组软骨细胞增殖能力的差异。5、姜黄素在调控IL-1b下调Ⅱ型胶原、上调MMP-13表达可能的机制。IL-1b加或不加姜黄素刺激软骨细胞不同时间点,分别提取总蛋白,胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blotting检测IkBa、p-IkBa及核内外P65的蛋白表达水平。继续取第一代软骨细胞培养,分为空白对照组、IL-1b组、IL-1b(10)Curcumin组和IL-1b(10)PDTC(Pyrrol idinedithiocarbamic acid,inhibitor of NF-κB,0.1 mmol/L)组,免疫荧光技术检测各组NF-κB(nuclear factor-kappaB)p65核内外的表达情况。研究结果:1、成功分离大鼠软骨细胞,并通过甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化加以鉴定。2、IL-1β显著增加大鼠软骨细胞MMP-13表达,并显著降低Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。3、姜黄素能够逆转IL-1β下调Ⅱ型胶原的表达,上调MMP-13的表达。对IL-1b刺激的软骨细胞最佳处理时间的测定:在不同时间点姜黄素干预下MMP-13显著下降,而Ⅱ型胶原显著增加,MMP-13在36 h达到峰值,Ⅱ型胶原在48 h达到峰值。姜黄素对IL-1b刺激的软骨细胞最佳处理浓度的测定:在不同浓度的姜黄素干预下,明显上调Ⅱ型胶原的表达,并显著抑制IL-1b预处理中软骨细胞MMP-13表达,姜黄素对Ⅱ型胶原和MMP-13表达调控的最佳浓度为50mM。4、姜黄素能够逆转IL-1b抑制软骨细胞增殖活性。IL-1b刺激的软骨细胞药物干预治疗后增殖活性逐渐增加,而IL-1b单独处理的软骨细胞增殖活性逐渐降低。虽然每个药物干预组细胞增殖活性显著升高,但各治疗组间软骨细胞增殖活性无显著差异。5、姜黄素能够逆转IL-1β下调Ⅱ型胶原的表达,上调MMP-13的表达可能是通过抑制NF-κB通路调控的。IL-1b刺激的软骨细胞,NF-κB p65核内移表现增加,姜黄素能够逆转NF-κB p65核内移,显著上调p65在核外的表达,使胞浆蛋白p65表达水平明显下降。与NF-κB抑制剂(PDTC)具有相似的功能。此外,姜黄素能够拮抗IL-1b诱导软骨细胞IkBa的磷酸化,抑制p-IkBa水平上升。研究结论:1、IL-1β抑制软骨细胞Ⅱ型胶原、促进MMP-13的表达。2、姜黄素能够逆转IL-1b刺激的软骨细胞下调Ⅱ型胶原、上调MMP-13表达效应,在这里我们选用最佳的作用时间和浓度为48 h和50mM。3、姜黄素能够逆转IL-1b抑制软骨细胞增殖活性,在实验浓度无明显细胞毒副作用。4、姜黄素通过抑制IkBa的磷酸化,抑制NF-κB p65的核转位,上调Ⅱ型胶原的表达,下调MMP-13的表达。并且姜黄素和PDTC相似的拮抗作用提示两者软骨细胞的调控可能遵循相同的分子机制。