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国内外研究背景:1.结核病位居单一病原体引起病人死亡的严重传染病之首。耐多药菌株的流行、合并HIV感染、化疗时间较长等是目前阻碍结核病防治工作的几大障碍。2.传统疫苗主要用于疾病的预防,而近几年发展较快的治疗性疫苗可通过加强或调整患者的免疫功能达到治疗目的,特别是对一些慢性感染性疾病的治疗。目前结核病治疗性疫苗的研究主要集中在DNA疫苗、灭活分枝杆菌疫苗和活疫苗等几个方面。3.结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌,巨噬细胞首先发挥抗结核分枝杆菌作用。Th1型免疫应答在抗结核分枝杆菌感染过程中有重要的保护作用。IL-12是重要的免疫调节分子,主要诱导Th1型细胞免疫应答。4. GLS是人NK细胞和CTL细胞产生的一种天然抗菌肽,具有抗多种微生物和肿瘤的活性。血清GLS水平和宿主的细胞免疫应答密切相关。GLS可直接杀灭细胞外的Mtb,通过改变细胞膜的完整性,在穿孔素辅助下可进入巨噬细胞中对胞内吞噬的Mtb进行杀伤。研究目的:构建可靶向递送pZM03进入肺泡巨噬细胞进行表达的GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗,并从体外细胞水平、活体水平探讨其诱导GLS和IL-12的表达,激发小鼠抗结核特异性免疫反应的能力;观察该重组活疫苗对结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠的治疗作用,并用抗痨药物及免疫调节剂-微卡等评估其治疗效果。研究方法:1.通过分步克隆,分别将GLS基因片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindIII/BamHI位点中、鼠单链IL-12基因亚克隆入NotI/KpnI位点中、分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入NheI位点中,形成穿梭/共表达质粒pZM03并导入巨噬细胞中进行表达。通过RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫细胞化学等方法从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测。2.将pZM03质粒电转化耻垢分枝杆菌标准株ATCC607,制备GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌,PCR进行鉴定,扩增;洗涤后导入RAW264.7细胞后作RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA对表达产物进行检测。3.以pZM03,BCG,ATCC607,重组耻垢分枝杆菌,灭活重组耻垢分枝杆菌,生理盐水6组滴鼻免疫BALB/c小鼠3次,4周后观察肺脾病理改变;作抗酸染色了解重组菌的分布;免疫组织化学和RT-PCR检测GLS、IL-12在组织中的表达;特异性PPD抗原刺激后脾淋巴细胞增殖情况;支气管灌洗液SIgA、血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IgG2a含量测定。4.刮取改良罗琴氏培养基生长4周的结核分枝杆菌H37Rv标准株,加0.05%Tween80生理盐水磨菌制成悬液,用菌落计数后以每只小鼠5X104CFU/50μl滴鼻感染,制作结核分枝杆菌感染模型。5.结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、耻垢分枝杆菌、pZM03、重组耻垢分枝杆菌治疗6次,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。6.结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、重组耻垢分枝杆菌、抗痨药(INH+PZA)、重组耻垢分枝杆菌+INH+PZA、微卡+INH+PZA等治疗3个月后,通过观察小鼠肺、脾病理改变及体内免疫状态的调整等评估重组疫苗的治疗效果。实验结果:1.成功构建了携带GLS、小鼠单链IL-12、分枝杆菌复制子OriM的穿梭/共表达质粒pZM03,导入巨噬细胞后通过RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学等方法从转录和翻译水平都检测到了目标基因的表达产物。2.成功得到了靶向性良好的GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌,导入RAW264.7细胞后RT-PCR检测到了GLS和IL-12的表达。3.以重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB/c小鼠,4周后肺脾组织无明显病理改变,免疫组化检测到GLS的表达,血清IFN-γ、IL-12和IgG2a含量、PPD刺激后脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量较其它对照组明显增高。4.结核分枝杆菌H37Rv 5X104CFU/50μl滴鼻感染小鼠4周后,所有小鼠肺、脾组织中均可见抗酸阳性菌,肺、脾组织可检测出细菌,肺组织病理改变明显,正常肺泡结构消失,以充血实变、淋巴细胞、巨噬细胞浸润为主,增生性改变不明显,未见明显的组织坏死。脾组织病理改变主要是巨噬细胞增生。5.重组耻垢分枝杆菌滴鼻治疗12周后,肺组织病变范围和程度与其它组比较明显好转;肺和脾的器官荷菌量也降低;小鼠脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α、血清中IL-12和IFN-γ的分泌水平及支气管肺泡灌洗液PPD特异SIgA都明显高于其它组;免疫组化法检测到小鼠肺和脾组织中GLS的表达。6.用INH+PZA、重组耻垢分枝杆菌联合INH+PZA及微卡联合INH+PZA同时治疗12周后,结果显示:单独使用重组耻垢分枝杆菌在病理改变、荷菌量降低方面的效果不如INH+PZA,但Th1免疫应答好于INH+PZA;重组耻垢分枝杆菌联合INH+PZA治疗效果优于单独INH+PZA和微卡联合INH+PZA的治疗效果。结论:1.人颗粒溶素和小鼠IL-12能在小鼠巨噬细胞中实现共表达;2.利用耻垢分枝杆菌作为生物体载体廉价、大量克隆并靶向递送外源治疗性基因进入巨噬细胞中表达是可能的;3.体内外实验都表明,GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌疫苗具有良好的靶向性,并能在体内外表达,激发小鼠针对结核杆菌的特异性Th1型细胞免疫和分枝杆菌特异性粘膜免疫应答;4.重组耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,与增强宿主Th1型免疫应答达和GLS的抗菌活性有关;重组耻垢分枝杆菌对临床常用的抗结核药有协同作用。