白酒是中国的国酒,其组成非常复杂,除了乙醇和水之外,还含有微量的挥发性与非挥发性成分。挥发性成分是构成白酒独特香气特征的物质基础,而非挥发性成分对于白酒的整体香气特征具有重要的影响,且它们往往具有健康功能。明晰白酒中非挥发性物质的存在及含量,对研究白酒的整体香气特征以及探究白酒与人体健康之间的关系至关重要,同时对于提升白酒的品质、增强国际影响力也具有十分重要的意义。但现有的对于白酒中非挥发性成分的研究还不够深入和系统。本课题针对我国传统发酵食品“芝麻香型白酒”中的非挥发性成分——多肽展开研究,系统地建立了白酒复杂体系中多肽的定性和定量方法,研究了多肽的抗氧化活性及其对白酒整体香气特征的影响情况。本文的主要研究内容和结果如下:(1)采用直接浓缩法、葡聚糖凝胶层析法、液液萃取浓缩法分别对国井芝麻香型白酒中的多肽组分进行分离提取,并且结合高分辨液相色谱-飞行时间质谱仪(HPLC-Q-TOF-MS)对三种方法的提取效果进行对比。结果表明,直接浓缩法对于白酒中微量的多肽组分的提取效果差,葡聚糖凝胶萃取法对于提取分子量≤200 Da的微量组分有较好的效果,而液液萃取浓缩法对于提取白酒中的多肽组分(≤1000 Da)具有较好的效果,且该方法的回收率(82.2~120.2%)和重现性良好。(2)选取2种具有代表性的芝麻香型白酒(景芝芝麻香型白酒和国井芝麻香型白酒)作为研究对象,应用液液萃取浓缩法结合HPLC-Q-TOF-MS对2种白酒中的多肽组分进行定性分析,共计定性出4条多肽,分别是Ala-Lys-Arg-Ala(AKRA),Asp-Arg-Ala-Arg(DRAR),Pro-His-Pro(PHP),Pro-Pro-Asp-Gly(PPDG)。采用内标法对上述4条多肽进行定量分析,多肽含量范围是8.497~66.524μg/L。(3)对2种芝麻香型白酒中定性出的4条多肽在DPPH、ABTS、ORAC、亚铁离子螯合力和还原力等方法中的抗氧化活性进行考察,研究发现,4条多肽均具有非常微弱的DPPH·、ABTS~+、ORAC自由基清除作用(0.006~0.04μmol TE/μmol),但均无亚铁离子螯合能力;AKRA(12.91μmol TE/μmol)、DRAR(12.58μmol TE/μmol)具有非常强的还原力作用,PHP、PPDG则表现出微弱的还原力作用。通过对组成AKRA和DRAR的氨基酸Ala、Lys、Arg、Asp、Pro、His和Gly的还原力进行测定,它们的还原力大小为:Lys>Ala>Arg>Asp=Gly>Pro(TE值分别为16.98,13.51,12.38,11.58,11.58和6.45μmol TE/μmol),表明AKRA和DRAR的强大的还原力可能是因为其中所含有的Lys、Ala和Arg所致,多肽序列中抗氧化氨基酸残基的存在是决定多肽是否具有抗氧化活性的关键性因素。(4)建立由2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)诱导的人肝癌细胞(HepG2)氧化损伤模型,深入研究4条多肽对氧化损伤的HepG2细胞的保护作用。探究了不同浓度的多肽对HepG2细胞存活率的影响;考察了多肽对细胞内ROS的清除作用及胞内抗氧化酶、非酶抗氧化剂活性的影响。结果表明,HepG2细胞的存活率随着多肽浓度的增加而降低;在一定浓度范围内,4条均具有直接清除细胞内ROS的能力;也能够增加损伤细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原性谷胱甘肽(GSH)的水平;同时还能够降低细胞膜上脂质氧化中间产物丙二醛(MDA)以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)的产生。(5)采用实时荧光定量PCR和免疫印迹Western blotting技术深入研究了4条多肽的抗氧化调节机制,考察肽对于损伤细胞的抗氧化酶、核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)和胞质接头蛋白(Keap1)的影响。结果表明,在一定浓度范围内,4条多肽都能够上调抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的mRNA和蛋白的表达量,与此同时促进Nrf2/Keap1复合物的解离,使得Nrf2的mRNA和蛋白的表达量上升而Keap1的mRNA和蛋白的表达量下降。这说明,4条多肽都通过激活Nrf2从而促进Nrf2与抗氧化反应元件(ARE)结合的信号转导机制来调控抗氧化酶的基因和蛋白表达,从而提高抗氧化酶的活性,清除细胞内由AAPH引发的过量的ROS,保护HepG2细胞减轻甚至免受氧化损伤。(6)建立顶空固相微萃取结合气质联机、气质-嗅闻仪联机(HS-SPME-GC-MS/GC-MS-O)方法,考察添加不同浓度(10~2000μg/L)的4条多肽前后,国井芝麻香型白酒中的挥发性香气化合物的挥发性能的改变,明晰多肽对于白酒整体香气的影响。结果表明,4条多肽均对此白酒的整体风味产生影响,尤其是酯类、醇类、酸类、醛类、酚类等化合物的释放量显著降低,并且呈现浓度依赖性。选取多肽AKRA为研究对象,以分子间相互作用为切入点,结合紫外-可见吸收光谱与核磁共振波谱,进一步考察了多肽与白酒中挥发性的异嗅味化合物——对甲酚之间的相互作用机制。结果表明,AKRA与对甲酚通过氢键进行结合,从而抑制对甲酚的挥发性能,降低由此带来的异嗅味。通过~1H NMR结合~1H-~1H NOESY进一步确认AKRA与对甲酚的结合位点,位于AKRA结构中的羰基氧与对甲酚酚羟基氢之间。