论文部分内容阅读
2型糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，随着生活方式改变和老龄化进程加速，我国2型糖尿病患病率正呈逐年上升趋势，给社会带来沉重负担和严峻挑战。糖尿病发病机制至今未明，目前认为遗传因素、环境因素、免疫异常以及炎症介质可能参与其中。作为一个具有显著遗传背景的疾病，遗传因素在2型糖尿病发病中占有重要地位，同时，基因变异又增加了该类疾病的遗传异质性。因此研究2型糖尿病遗传异质性有助于阐明其发病机制。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorcoactivator-1alpha，PGC-1α)是一种核转录激活因子，通过辅助激活核受体家族如PPAR-α、PPAR-γ、雌激素受体α(ERα)、糖皮质激素受体(GR)、盐皮质激素受体(MR)、甲状腺激素受体(TR)和维甲酸类X受体(RXR)等调节目的基因转录及转录后的剪接修饰过程。该基因是近年克隆的一个调控机体糖脂代谢的重要基因，其在调节肝糖异生、骨骼肌葡萄糖转运、胰岛素敏感性、适应性产热、线粒体功能、脂肪细胞分化、脂肪酸β氧化和胆固醇逆向转运等方面发挥重要作用。鉴于此，PGC-1α基因已经成为2型糖尿病的一个重要候选基因。
1.人pGEMTeasy-(PGC-1α-ID)的定点诱变各突变引物横跨突变碱基，以pGEMTeasy-(PGC-1α-ID)(即野生型M)为模板，在pfu高保真DNA聚合酶催化下，通过变性、退火、延伸的12次循环，定点诱变394位点形成pGEMTeasy-M1；定点诱变482位点形成pGEMTeasy-M2；再以pGEMTeasy-M1为模板，定点诱变其482位点形成pGEMTeasy-M3诱变体。经DpnI限制性内切酶识别野生型模板链Gm6ATC序列，消化切碎模板连。扩增产物经纯化回收，转化XL1-Blue超级感受态细胞，表达氨苄青霉素抗性标签后，经LB-Amp/IPGT/X-Gal平板筛选，挑取白色单克隆菌落37℃过夜振荡培养，扩增突变质粒。抽提质粒测序证实各突变点序列和方向正确。
2.人pBT-(PGC-1α-ID)表达载体构建
pGEMTeasy-(PGC-1α-ID)野生型及定点诱变形成的3种突变质粒，经EcoRⅠ、BamHI双酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的带割胶回收纯化，分别与经同样双酶切的诱饵载体pBT在T4DNA连接酶催化下，16℃过夜连接。连接产物转化E.coliXL1-blueMRFKan(lacIq)超级感受态细胞，37℃培养1h表达氯霉素抗性(Cmr)标签后，经LB-Cm/IPGT/X-Gal平板筛选，挑取白色单克隆菌落LB-氯霉素(34μg/ml)液体培养基30℃过夜培养。抽提扩增的质粒DNA，测序证实序列和方向均正确，证实成功构建人pBT-M、pBT-M1、pBT-M2、pBT-M3等4种诱饵质粒，-20℃保存。
3.人pTRG-(MEF2C-ID)表达载体构建
依据克隆策略，BamHI、EcoRⅠ双酶切pGEMTeasy-(MEF2C-ID)和靶载体pTRG，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳割胶回收纯化，分别与经同样双酶切的靶载体pTRG在T4DNA连接酶催化下，16℃过夜连接。连接产物转化E.coliXL1-blueMRFKan(lacIq)超级感受态细胞，37℃培养1h表达四环素抗性(Tetr)标签后，经LB-Tet/IPGT/X-Gal平板筛选，挑取白色单克隆菌落LB-Tet(75μg/ml)液体培养基30℃过夜培养。抽提扩增的质粒DNA，测序证实序列和方向均正确，-20℃备用。
4.氨苄青霉素抗性筛选实验
结果显示，在菌液稀释100倍时M2和M3组隐约可见蓝斑，增加至1000倍时菌落未形成，而此时尚可见M组和M1组有菌落形成，但大小和光泽程度均较前下降。说明M2组和M3组氨苄青霉素抗性基因表达量减少，提示蛋白质相互作用力较野生型M和M1下降。氨苄青霉素抗性实验证实了M2和M3组蛋白质相互作用力减小，作用力的定量以及二组间的作用力差异可经β-半乳糖苷酶活性实验定量检测。
5.β-半乳糖苷酶活性检测
4种诱饵质粒pBT-M、pBT-M1、pBT-M2、pBT-M3与靶质粒pTRG-(MEF2C-ID)之间存在相互作用，pBT-M2和pBT-M3分别与各组比较作用力明显减弱(P＜0.05)，且pBT-M2和pBT-M3比较差异也有显著性(p＜0.05)。
结论
1.Gly482Ser(G→A)变异可引起PGC-1α-ID与MEF2C结合力减弱；
2.Thr394Thr(G→A)单独变异对PGC-1α-ID与MEF2C结合力无明显影响；
但与Gly482Ser(G→A)同时变异可使二者结合力降低。