研究背景与目的：恶性肿瘤是人类健康的重要杀手之一,给人们带来严重危害,但至今尚未明确其发病原因和发病机理。结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,严重危害人类的健康。研究发现结肠癌患者都有不同程度的免疫功能低下,如B细胞和T细胞增殖能力下降、IL-10含量上升,而IL-2含量下降等,这也是导致肿瘤免疫逃逸和无限制增长的一个重要因素。结肠癌的治疗方法是以手术为主,辅以化疗、中药免疫治疗以及其他支持治疗的综合方案,以提高手术切除率,降低复发率,提高生存率。研究表明,中药可以增强结肠癌患者自身身体的免疫力,从而提高自身的抗癌能力,改善体质状况,从而使患者康复。积雪草为伞形科积雪草属植物,是中国药典收载的常用中药,其性寒、味苦、辛,具有解毒消肿、清热利湿、刺激生物合成、促进伤口愈合、抗胃溃疡等多种药理作用。羟基积雪草酸是积雪草中有效活性成分,研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、调节免疫等多种药理活性功能,尤其是对肿瘤细胞具有显著的抑制作用。目前有关羟基积雪草酸治疗结肠癌的报道较少,本研究将用羟基积雪草酸处理裸鼠结肠癌细胞CT26和CT26细胞诱导的荷瘤裸鼠,观察其抗肿瘤效应,以及相关免疫调节和细胞信号通路机制,对开发低毒、新型药物靶点的抗肿瘤中药而言,具有重要的意义。方法：本研究首先从积雪草中分离纯化羟基积雪草酸,用以处理裸鼠结肠癌细胞CT26细胞,通过JC-1染色检测CT26细胞线粒体膜电位的变化,并结合Hochest染色来判断羟基积雪草酸是否能诱导结肠癌细胞CT26凋亡。接下来,进一步探讨羟基积雪草酸的抗肿瘤效应,将建立NOD/SICD裸鼠皮下移植瘤模型,然后使荷瘤裸鼠灌胃服用0μg/mL(空白对照组)、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、250μg/mL羟基积雪草酸,观察肿瘤生长情况,以明确羟基积雪草酸的抗肿瘤效应。同时,为观察肿瘤减少的机制,将CT26细胞注射入裸鼠腹腔,建立腹水移植瘤模型,并用羟基积雪草酸处理；然后取腹水细胞,检测腹水细胞凋亡和增殖效应,确定羟基积雪草酸抑制肿瘤生长的机制。最后,从免疫调节入手,来检测脾脏T淋巴亚群细胞CD4+、CD8+T细胞的增殖能力,以及IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌情况,对羟基积雪草酸发挥抗肿瘤作用的机制进行探讨；另一方面,通过检测NF-κB蛋白的表达,用以明确NF-κB信号通路在结肠癌发生中的作用机制。结果：1g积雪草中可提取(0.252±0.038)mg羟基积雪草酸,且回收率高,平均可达99.7%。JC-1染色表明250μg/mL羟基积雪草酸具有最强的促CT26细胞凋亡能力,呈现浓度依赖性凋亡；Hochest染色结果发现在50μg/mL和250μg/mL羟基积雪草酸组,大量蓝色荧光细胞开始出现,同时出现典型的凋亡小体,染色质浓缩,核碎裂成大小不等的圆形小体；JC-1染色和Hochest染色结果提示羟基积雪草酸在体外具有促肿瘤细胞凋亡效应。荷瘤小鼠模型构建成功后,肿瘤组织用于HE染色,染色结果可见移植瘤形态相对规则,呈椭圆形,肿瘤有包膜,体积较大,部分细胞胞质透亮,细胞核大,异型性明显,出现病理性核分裂；移植瘤体积和重量分别为2.58cm3和11.3g。当裸鼠服用羟基积雪草酸后,羟基积雪草酸进入裸鼠体内与肿瘤细胞作用,会影响肿瘤细胞成瘤；50mg/kg和100mg/kg羟基积雪草酸抗肿瘤效果最好,重量分别减少到2.12g和2.10g,体积分别减小到0.65cm3和0.58cm3。Annexin V-FITC/PI染色结果表明50mg/kg羟基积雪草酸组凋亡细胞数较无药物处理组多,且部分细胞已进行凋亡晚期,这可能是引起肿瘤消退的原因。脾脏T淋巴细胞亚群检测结果发现细胞经过羟基积雪草酸处理后,与对照组相比,CD4+和CD8+T淋巴细胞数量均大量增加,CD4+T淋巴细胞由无药物处理的9.53%上升到经药物处理的21.38%,CD8+T淋巴细胞则由6.18%上升到10.07%。CD4+/CD8+细胞比值则从1.54上升到2.12,提示T淋巴细胞的增殖能力增强,加强了免疫凋节作用,促进了肿瘤细胞的凋亡。进一步地,ELISA检测结果表明脾脏单个核细胞与羟基积雪草酸孵育24h和48h后,IL-2、TNF-α和IFN-γ细胞因子的表达都明显增加,特别是在48h后与对照组相比有明显统计学差异(P<0.05)。本研究使用Western blot检测移植瘤组织中NF-κB的表达。实验结果表明,在荷瘤裸鼠体内,NF-κB被激活,而经羟基积雪草酸处理后,NF-κB的表达明显下调,由此证明了NF-κB与癌症发生密切相关。结论：积雪草中含有有效的抗肿瘤活性成分羟基积雪草酸,羟基积雪草酸可以在体外诱导肿瘤细胞凋亡,体内促进裸鼠移植瘤消退；其抗肿瘤机制是通过免疫调节和NF-κB信号通路介导的,提示在使用有抗肿瘤作用的中草药时,可从免疫调节和信号通路两方面辅助治疗肿瘤,以期在临床上取得更好的效果。