生物心脏起搏器是心血管领域研究热点问题。当前构建生物心脏起搏器主要包括基因转染、细胞移植和组织工程化起搏、传导组织移植三种方法。基因转染普遍存在外源基因在体内缺乏长期稳定表达、难以有效调控等缺点。细胞移植，组织工程化起搏、传导组织移植可以避免通过转染基因建立生物起搏器的缺点。但是，目前在心脏生物起搏器研究中探讨的组织细胞(窦房结细胞、幼稚心肌细胞、基因转染的心肌细胞等)、胚胎干细胞、间充质干细胞，均有其目前无法克服的弊端，寻找新的种子细胞，是心脏生物起搏器研究的当务之急。本研究拟采用条件培养、与起搏细胞联合培养等方法，探讨将骨髓多能成体祖细胞诱导分化为起搏细胞的可能性，旨在为心脏生物起搏器的构建提供一种来源丰富、无排斥反应、活性好的种子细胞。研究发现，5-氮杂胞苷+内皮素-1、窦房结细胞培养液等条件培养可使MAPCs表达起搏离子通道，与窦房结细胞共培养能将MAPCs诱导分化为起搏样细胞；该细胞体外具有驱动心肌跳动的起搏活性。　　 研究目的：　　 病态窦房结综合症、房室传导阻滞等缓慢型心率失常严重威胁人类健康，而电子起搏器存在诸多问题，制约了它的应用。生物心脏起搏理论上可以克服电子起搏器的缺陷，有很好的临床应用前景。　　 当前构建生物心脏起搏器主要包括基因转染、细胞移植和组织工程化窦房结、房室结、传导束移植三种方法。基因转染普遍存在外源基因在体内缺乏长期稳定表达、难以有效调控；缺乏高效、安全、导向性好的载体系统等缺点。细胞移植建立心脏生物起搏器可以避免应用基因转染方法建立生物起搏器的缺点，而组织工程化窦房结、房室结、传导束的构建将心脏生物起搏器的研究提高到组织、器官水平。然而，目前在心脏生物起搏器研究中涉及细胞包括：组织细胞(窦房结细胞、幼稚心肌细胞、基因转染的心肌细胞等)，存在着对移植部位微环境适应能力差及供体来源困难等问题；胚胎干细胞，有报道表明胚胎干细胞分化的自发跳动的心肌细胞移植到心脏后可以发挥起搏功能，并对神经性调节有反应，但是胚胎干细胞具有向终末细胞分化的特性，而分化的终末细胞则失去起搏特性，精确控制其分化方向尚难解决，以及免疫排斥反应问题；间充质干细胞，虽然在体外能够将间充质干细胞诱导分化为具有起搏电流的细胞，但间充质干细胞并没有特异的起搏离子通道，单一的起搏电流(If)能否持久维持起搏功能，尚缺乏实验依据，因此，一般认为，间充质干细胞诱导来的具有起搏功能的细胞在体内并不能替代起搏细胞，仅作为携带起搏基因的载体。可见，寻找新的种子细胞，是心脏生物起搏器研究的当务之急。　　 骨髓源性多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPCs)，可来源自体、取材方便、活性好、分化增殖能力强，如能诱导分化为起搏细胞则可以将心脏生物起搏器的研究推进到可临床应用的层面，然而，目前尚无MAPCs向起搏细胞诱导分化的报道。　　 本研究拟采用条件培养、与起搏细胞联合培养等方法，探讨将MAPCs诱导分化为起搏细胞的可能性，旨在为心脏生物起搏器的构建提供一种来源丰富、无排斥反应、活性好的种子细胞。　　 第一部分MAPCs的分离、培养和鉴定　　 研究目的:进行MAPCs的分离、培养和鉴定，获取可用于向起搏细胞诱导分化的种子细胞。　　 材料与方法:全骨髓培养法、MAPCs专用培养基培养1月龄大鼠胫骨和股骨骨髓。培养1个月后，经免疫磁珠法分选CD45阴性细胞，克隆培养并扩增。经鼠SSEA-1多克隆抗体流式细胞检测阳性细胞百分比，Oct-4、SSEA-4、CD44、CD45、CD133、MHCⅡ免疫荧光检测细胞表面标志，并经Western Blot分析Oct-4蛋白的表达。　　 结果:培养的MAPCs细胞呈长梭形，细胞潜伏期短，24h后已经开始增殖，倍增时间为2d。蛋白表达Oct-4+、SSEA-4+、CD44-、CD45-、CD133-、MHCⅡ-，流式细胞技术检测SSEA-1阳性细胞为86.41％。　　 结论:成功分离培养了MAPCs。　　 第二部分条件培养基对MAPCs的诱导分化　　 研究目的:分别采用5-氮杂胞苷+内皮素-1、窦房结细胞培养液诱导MAPCs，探讨条件培养基将MAPCs诱导分化为起搏细胞的可能性。　　 材料与方法:分别用10mmol/L的5-氮杂胞苷结合10-8M的内皮素-1和窦房结细胞培养后的培养液诱导5～10代MAPCs。免疫荧光检测α-SMA、mlv2α、HCN2、HCN4蛋白表达；real-time PCR检测HCN1、HCN2、HCN4等基因的表达。　　 结果:5-氮胞苷与ET-1联合使用的方法诱导MAPCs，细胞形态发生明显变化，细胞变大，多数呈大三角形。诱导后细胞表达心肌细胞标志物α-SMA、mlv2α，编码起搏电流If的HCN2、HCN4，多能性干细胞标志物Oct-4和SSEA-4不再表达。窦房结细胞培养液诱导MAPCs后细胞同样变大，但突起较少，基本还保持长梭形；窦房结细胞培养液培养后的细胞HCN2、HCN4免疫荧光染色表达阳性，而Connexin43和TnT则基本不表达；real-time PCR检测HCN2、HCN4、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表达，但是远低于培养的窦房结中的表达水平。　　 结论:条件培养不能将MAPCs诱导分化为典型的起搏细胞，但具备起搏离子通道。　　 第三部分窦房结细胞共培养对MAPCs的诱导分化　　 研究目的:通过MAPCs与窦房结细胞共培养的研究，探讨共培养将MAPCs诱导分化为起搏细胞的可能性。　　 材料与方法:首先将差速贴壁结合BrdU培养的新生大鼠窦房结细胞接种于6孔板上，然后将MAPCs第5代细胞加入Transwell小室，密度为每孔1×104个细胞。将种植细胞的Transwell小室插入6孔板中，在37℃5％CO2培养箱中培养。分别在共培养1周、2周、3周和4周后，免疫荧光化学、real-time PCR检测相关分子的表达。　　 结果:共培养后，与条件培养类似，细胞变大，但突起较少，基本还保持长梭形。相关标志物HCN4、Connexin40和Connexin45免疫荧光染色表达阳性，HCN2表达弱，而Connexin43和TnT则基本不表达；real-time PCR检测HCN2、HCN4、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表达，表达高于条件培养组而低于培养的窦房结。随培养时间的延长mRNA略有增加，但3周后就基本达平台期。Cav3.1、Kir2.1基因的表达少或基本不表达。　　 结论:与窦房结细胞共培养不能将MAPCs诱导分化为典型的具有自发搏动活性的起搏细胞，但与条件培养基诱导分化相比，更接近起搏细胞，我们暂称之为起搏样细胞。　　 第四部分起搏样细胞起搏功能的体外检测　　 研究目的:将与窦房结细胞共培养2周获得的起搏样细胞，种植在静息的新生大鼠心肌细胞单层上，观察细胞搏动情况，探讨该细胞对心肌的起搏作用。　　 材料与方法:将与窦房结细胞共培养2周获得的起搏样细胞，种植于静息的新生大鼠心肌单层上，观察细胞搏动情况。分别加入1×10-7mol/1异丙肾上腺素和先加入1×10-6mol/1心得安再加入异丙肾上腺素观察细胞搏动频率的改变。　　 结果;静息新生大鼠心肌细胞重新出现搏动，频率为60次/分左右；加入异丙肾上腺素3天后，搏动频率达到100次/分。而在预先加入心得安的混合培养细胞中再加入异丙肾上腺素则搏动频率未有明显增加。　　 结论:与窦房结细胞共培养的MAPCs体外具有驱动心肌跳动的起搏活性。