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广谱中和抗体就是能够中和一种病毒的很多不同毒株的抗体,在预防和治疗病毒感染中起到非常重要的作用,成为预防HIV的第一道防线。因此寻找具有广谱中和活性的单克隆抗体一直是HIV-1治疗和疫苗研究的一个重要方向。近年来随着B细胞培养技术的突破和改进,从HIV感染者中分离获得广谱中和抗体的概率和数量大大提高。例如分离的VRC01类抗体、PT系列和PGT系列抗体能中和目前世界范围内流行的大多数毒株,尤其是VRC01类抗体能中和90%以上的世界流行株。本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外用hCD40L-3T3作为饲养细胞并使用细胞因子IL-2和IL-21诱导记忆性B细胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法做筛选。从有中和活性的孔中分别扩增出B细胞IgG的轻链和重链基因,并将其克隆到含IgG恒定区基因的载体上。然后将携带重链和轻链基因的质粒进行大量表达,得到人单克隆抗体,并进行抗体结合活性、中和活性及与抗原gp120亲和力的鉴定。结果从我国3例HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1Env抗原有结合活性的单克隆抗体。其中8E7和55B3主要与gp120结合,19GF3与gp120和FLSC均可结合且结合活性无明显差异;基因变异大的8E7抗体对A、B、C三种亚型的假病毒均有一定的中和活性,55B3对SF162有中和活性,19GF3未检测到中和活性;这三种单抗的亲和力都很强,对Gp120蛋白的亲和力达到8E7、19GF3、55B3对Gp120蛋白的亲和力分别达到6.45×10-10 mol/L、1.12×10-10 mol/L、2.76×10-10 mol/L。在HIV的包膜表面刺突的分布非常稀疏,中和抗体的两个抗原结合表位很难同时结合到一个病毒颗粒上的两个刺突来发挥中和作用,也就是说两个抗原结合表位很多时候只有一个能发挥作用。为了更好克服空间位阻,让所有抗体的Fab都能发挥作用,本实验室在前期构建了半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM),初步的研究结果表明半分子型单价抗体与亲本IgG抗体的中和活性相比有所提高,本研究对前期已构建的单价抗体的中和活性做了更系统的检测,并对ADCC活性的发挥以及抗体在体内的半衰期进行了检测。结果显示,在单独应用时单价抗体的中和活性与IgG比较有明显的提高,其中VRC01抗体提高的幅度最大,有3.74倍的提高。在对这三种单抗进行两两组合对不同假病毒进行的体外中和实验中,HM型单价抗体对病毒的中和活性明显强于其原型IgG组合,主要表现在HM型抗体组合的IC80值普遍低于对应的IgG组合;对于很难中和的病毒THRO.c/2626,两种单价抗体组合(NIH45-46-HM与PG9-HM抗体、NIH45-46-HM与VRC01-HM)均检测到明显的中和活性,而对应的IgG组合则未检测到中和活性;三种单价抗体联合应用时IC80值明显低于两种抗体的组合。另外,我们以2G12抗体为模型,比较了在IgG或HM型单价抗体介导的NK细胞对Gp120蛋白负载的CEM-NK’-CCR5细胞的杀伤活性,结果显示,IgG抗体有明显的ADCC活性,但改造后的HM抗体ADCC活性丧失。但对改造前后的抗体在小鼠体内的半衰期的比较结果显示,单价抗体半衰期与原型IgG相比无明显变化,说明HM型单价抗体虽然分子较小,但并未很快被清除,这与较小的抗体分子Fab和scFv在体内很快被清除的特性有很大的差异,在实际应用中也更有优势。在此基础上,我们构建了新筛选出的3株对HIV-1 Env抗原有结合活性的单克隆抗体(8E7、55B3和19GF3)的单价抗体,并对其结合活性和中和活性进行了研究。体外结合实验证明构建的单价抗体与亲本单克隆抗体在结合活性方面无明显差异。在中和活性上,我们分别在体外不同的假病毒进行了体外中和试验,检测其IC50值。结果显示,8E7抗体能中和的病毒,HM型(IgG half molecule,IgG-HM)大多数也能中和,表明了单价抗体基本保持了亲本抗体的中和活性。综上所述,我们成功建立了在96孔板中高效刺激人B细胞在体外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和实验和RT-PCR技术筛选得到了对HIV-1具有中和活性的人单克隆抗体。此方法不仅应用于HIV中和抗体的筛选,对其他感染者疾病的人单克隆抗体的筛选领域也有很好的应用前景。我们的结果还提示在两种或多种抗体联合应用中,单价抗体与二价IgG分子相比能更好地发挥两种抗体的中和作用,为HIV-1感染的抗体治疗提供了新的思路。