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旋毛虫(Trichinella spiralis)和弓形虫(Toxoplasma gondii)是两种重要的食源性寄生虫,具有相似的感染途径和宿主范围。由于两种病原分别属于多细胞的线虫和单细胞的原虫,因此它们感染宿主后诱导的免疫应答也截然不同。旋毛虫感染宿主诱导Th2型为主的免疫应答,弓形虫感染宿主诱导Th1型为主的免疫应答。众所周知,巨噬细胞在调节Th1和Th2型免疫应答方面发挥关键作用。两种病原的共感染改变了宿主对每种病原的免疫应答反应,进一步增加了对食品安全和人类健康的威胁。阐明旋毛虫与弓形虫感染同一宿主的致病机理和免疫机制是防控两种病原共感染的重点。本研究旨在探究由旋毛虫活化巨噬细胞诱导产生的Th2型免疫应答对弓形虫再感染的调节作用,明确旋毛虫诱导活化巨噬细胞介导Th2型免疫应答调节弓形虫再感染的分子机制,为防控旋毛虫和弓形虫感染同一宿主奠定理论基础。本研究建立了旋毛虫-弓形虫同时感染、旋毛虫先期感染-弓形虫继发感染和弓形虫先期感染-旋毛虫继发感染BALB/c小鼠模型。通过ELISA方法检测了共感染小鼠外周血Th1和Th2型细胞因子水平的变化;利用流式细胞技术评价了共感染小鼠外周血中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞变化情况;显微镜计数方法检测了共感染小鼠旋毛虫荷虫量;q RT-PCR方法检测了共感染小鼠弓形虫荷虫量。结果显示单独旋毛虫感染主要诱导以Th2型细胞因子(IL-4)升高和CD4~+T细胞增加为标志的Th2型免疫应答;单独弓形虫感染主要诱导以Th1型细胞因子(IFN-γ)升高和CD8~+T细胞升高为标志的Th1型免疫应答;旋毛虫与弓形虫同时感染诱导Th1/Th2型混合免疫应答,且弓形虫感染可以推迟旋毛虫感染诱导的Th2型细胞因子达到峰值的时间,旋毛虫感染可以推迟弓形虫感染诱导的Th1型细胞因子达到峰值的时间;旋毛虫感染6周后弓形虫继发感染,诱导比旋毛虫单独感染时较低的CD4~+T细胞和较高的CD8~+T细胞为特征的免疫应答;弓形虫感染6周后旋毛虫继发感染诱导比弓形虫单独感染较高的CD4~+T细胞和较高的CD8~+T细胞为特征的免疫应答;旋毛虫和弓形虫共感染小鼠与单独寄生虫感染小鼠相比,尽管无法显著改变旋毛虫荷虫量,但可以显著增加弓形虫荷虫量。以上研究结果表明旋毛虫感染诱导与弓形虫感染截然相反的免疫应答,即旋毛虫感染主要诱导抑制炎症反应的Th2型免疫应答,弓形虫感染主要诱导促进炎症反应的Th1型免疫应答;旋毛虫/弓形虫共感染时,诱导的两种免疫应答相互影响,互相拮抗,即旋毛虫感染诱导的免疫应答可以抑制弓形虫感染诱导的免疫应答;旋毛虫感染可以促进弓形虫的感染,但是弓形虫感染无法显著影响旋毛虫的感染。旋毛虫通过哪些分子调节宿主免疫应答影响弓形虫感染尚未明确。前期研究表明,旋毛虫可以通过ES抗原调节宿主Th2型免疫应答。本研究鉴定了旋毛虫ES抗原成分之一——硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPX2),并初步明确了旋毛虫TPX2通过活化巨噬细胞诱导小鼠Th2型免疫应答的机制。采用免疫组化和免疫荧光方法研究了TPX2蛋白在旋毛虫肌幼虫和成虫中的定位;以r TSTPX2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4~+T细胞和CD8~+T细胞含量,攻虫实验评价r Ts TPX2免疫保护效果;采用q RT-PCR和Western Blotting方法检测TPX2体外诱导活化的腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞的表型;利用MTS法评价了r Ts TPX2活化的巨噬细胞体外刺激CD4~+T细胞的增殖能力;将r Ts TPX2体外活化的腹腔巨噬细胞移植至健康BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测了血清中细胞因子和特异性抗体变化,流式细胞技术检测了外周血CD4~+T细胞和CD8~+T细胞含量,攻虫实验评价移植r Ts TPX2活化的巨噬细胞诱导的免疫保护效果。结果显示旋毛虫TPX2主要分布于旋毛虫肌幼虫和成虫的表皮层和杆状体中,少量分布于肌幼虫和成虫寄生部位的周围宿主组织中;以r Ts TPX2直接免疫小鼠可以诱导以Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)增加、Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-12和TNF-α)降低、Th2型特征性抗体(Ig G1)大量分泌为特征的Th2型为免疫应答,同时伴随CD4~+T细胞的增加和CD8~+T细胞的降低。并且r Ts TPX2诱导的上述免疫应答可以引起约35%成虫减虫率和45%肌幼虫减虫率。体外研究显示,r Ts TPX2可以直接诱导腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞分化成M2表型,表现为M1(i NOS-1)标志分子表达下调和M2(MRC-1、Arg-1、CCL22)标志分子表达上调;体外巨噬细胞/CD4~+T细胞共培养模型显示,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可以直接诱导CD4~+T细胞极化为Th2并大量增殖;将r Ts TPX2体外活化的巨噬细胞过继小鼠,可以诱导Th2型增强为特征的免疫应答,攻虫实验表明,r Ts TPX2活化的巨噬细胞可诱导44.7%的成虫减虫率和52.9%的肌幼虫减虫率。以上结果表明,旋毛虫TPX2可通过诱导M2亚群巨噬细胞活化进而抑制Th1型免疫应答而发挥抗旋毛虫感染作用。巨噬细胞是抗胞内病原感染重要效应细胞,在抗弓形虫天然免疫中发挥关键作用,旋毛虫诱导活化的巨噬细胞是否影响弓形虫感染?本研究进一步探究了旋毛虫诱导巨噬细胞活化以及诱导活化的巨噬细胞对弓形虫体外感染的影响。通过q RT-PCR和WB方法检测了体内和体外活化的巨噬细胞标志分子,明确了旋毛虫诱导活化的巨噬细胞表型;通过弓形虫速殖子体外感染巨噬细胞,明确不同活化方式的巨噬细胞对弓形虫感染的影响。结果显示体内旋毛虫感染诱导巨噬细胞以Arg-1、Fizz-1和MRC-1表达上调为标志的M2表型;旋毛虫肌幼虫ES抗原和r TSTPX2体外刺激RAW264.7和腹腔巨噬细胞,诱导以Arg-1和MRC-1上调,i NOS-1下调为标志的M2表型;M2表型的巨噬细胞可以增加弓形虫感染。表明旋毛虫可以通过直接诱导巨噬细胞替代途径活化调节弓形虫感染。综上所述,本研究初步阐明了旋毛虫诱导Th2型免疫应答的分子机制,明确了旋毛虫诱导的Th2型免疫应答对弓形虫感染的影响,初步确定了旋毛虫通过诱导巨噬细胞活化调节弓形虫感染的细胞机制。