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随着人类对地球资源开发的加剧,海洋污染也越来越严重。而在众多的污染中,以石油污染尤为突出,近年来,各种石油泄漏事故更是雪上加霜。2010年7月16日,大连新港溢油成为近年来大连乃至中国史上海洋最严重的溢油事故之一。针对于这一事故,项目组对大连湾海域展开连续5年的跟踪调查研究,以期掌握溢油事故对海洋生态环境造成的影响,初步了解大连湾环境中的微生物在石油污染中的自净与修复性能,揭示石油污染程度对微生物群落结构及多样性的影响。以大连湾表层海水和沉积物为研究对象,利用可培养方法研究溢油后5年间异养细菌和石油烃降解菌丰度的变化特征,并结合石油烃含量的分布以及环境因子的检测,探究细菌丰度与环境化学因子间的相关性。结果表明,溢油事故发生后5年间,大连湾表层海水中石油烃含量(TPHs)由溢油初期的0.22~0.67 mg/L降到0.0025~0.05 mg/L,海水质量由第三类海水转变为第一类海水;沿岸站位表层沉积物中石油烃含量由7 133μg/g降低到926μg/g,其表层沉积物质量也由第三类转变为第一类。溢油后2个月内表层海水中异养细菌及石油烃降解菌丰度分别升高至105 CFU/mL和104 CFU/mL,随着时间推移各站位细菌丰度基本呈下降趋势,5年后细菌丰度回落了1~2个数量级并基本恢复到溢油前的历史水平。表层沉积物中石油烃降解菌丰度由溢油后2个月的105 CFU/g降低到2013年的102 CFU/g。海水中石油烃降解菌与异养细菌的比值(HDB/HB)与石油烃含量呈极显著的正相关(P<0.01),而与营养盐和溶解氧等主要环境因子相关性不大,因此推断其可作为海水中石油烃类污染评价的指标。采用Illumina Miseq高通量测序的方法对大连湾沉积物中细菌群落结构进行研究,结果显示大连湾优势细菌门类主要为变形菌门(Proteobacterice),其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等,其中变形菌门的δ-变形菌(Deltaproteobacteria)、γ-变形菌(Gammaproteobacteria)、ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)分别占31.35%、26.31%、5.79%。δ-变形菌和γ-变形菌在大多数样品中占据优势地位。ε-变形菌的相对丰度在石油污染较严重的站位显著高于其它站位,且随石油烃浓度降低而逐渐降低。大连湾沉积物中与石油烃降解相关的细菌类群在总细菌群落中占有较高的比例(14.34~87.23%),包括Pseudomonadaceae,Piscirickettsiaceae,Thiotrichaceae,Halomonadaceae,Oceanospirillaceae,Oleiphilaceae,Vibrionaceae,Alteromonadaceae,Aeromonadaceae和Colwelliaceae等,且随时间推移,与石油烃降解相关细菌的相对丰度逐渐降低,尤其是受石油污染较明显站位的样品。通过对大连湾表层沉积物的细菌群落多样性指数及群落结构进行统计分析发现,离岸由近至远细菌群落的Tag序列数逐渐降低,而OTU数呈增加的趋势;溢油后5年间随着时间的推移,各站位石油烃含量逐渐降低,其细菌多样性也随之增加;由此推断石油烃含量可能影响细菌多样性;近岸站位细菌丰度、石油烃含量都较高,而其多样性相对较低。冗余度分析环境因子与细菌主要类群之间的关系表明:各种环境因子对沉积物样品细菌群落结构影响的相关性大小为总石油烃(TPHs)>总有机碳(TOC)>多环芳烃(PAH)>硫化物(S);结果表明石油可能是影响功能微生物群落结构和组成的主要因素,群落结构的变化与环境化学因子的变化可能具有相关性。采用Real-time PCR技术对沉积物中的细菌16S rRNA基因和烷烃羟化酶(AlkB)基因进行了定量分析,结果显示16S rRNA基因拷贝数范围是8.30×108~1.10×1010 copies/g,沉积物中细菌数量介于2.01×108~2.66×109 cells/g之间,明显高出可培养异养细菌总数2~3个数量级,说明大连湾沉积物中存在大量的未可培养细菌;16S rRNA基因拷贝数石油烃含量呈显著正相关(P<0.05),表明影响16S rRNA基因丰度的主要因素是石油烃含量;烷烃羟化酶(AlkB)基因拷贝数范围为5.32×106~6.32×107 copies/g,相较于溢油发生初期有明显的增加,表明石油污染对于土著的烷烃降解相关的基因起到了促进作用。本研究将为我们了解溢油事故海区细菌丰度及其群落分布提供了一定的基础,同时通过揭示石油污染程度对微生物群落结构及功能多样性的影响,也让我们对细菌群落构成与石油污染之间的响应有了更深的认知,同时为评估石油烃降解菌的作用提供了重要的基准信息。