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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.m.）是一种常见的食源性革兰氏阳性病原菌,常见于乳制品、果蔬等即食食品中。误食污染的食物可导致败血症、脑膜炎、热性肠炎和流产死胎等,致死率为15～30%。该菌对营养要求低、耐高盐、生长温度范围广,在食品生产及储存环节难以防治。橄榄叶提取物（Olive Leaf Extract,OLE）具有天然抑菌抗氧化活性、无生物毒性、产率高等特点,其主要活性物质为橄榄苦苷,可有效抑制L.m.生物膜形成,利用OLE逐步替代防腐剂及抗生素作为食源性病原菌L.m.的抑菌剂一直是食品安全领域的研究热点。由于OLE抑菌效价不高、OLE用料计算方法不够精确,导致OLE工业生产时用料量偏大,限制了OLE作为抑菌剂的商业化应用。本研究以单核增生李斯特菌（L.m.）对橄榄叶提取物（OLE）的抑菌应答作为研究对象,以OLE对L.m.绿色高效的抑菌作用为研究方向,利用Logistic函数对L.m.应答OLE的抑菌过程,建立轻量化OLE抑菌使用量的模型,采用遗传学（转录组检测、基因敲除、表型分析）和生物化学（靶标蛋白体外表达纯化、BLI亲和力分析）等手段对L.m.应答OLE关键基因进行挖掘及功能分析,主要研究结果如下:（1）基于OLE对L.m.-F2365的体外抑菌率数据,构建了抑菌率与OLE浓度的Logistic逻辑生长模型LM（R~2=0.88957）。构建的LM方程为:y=1/（1+exp（1.9366-0.11413 x））,利用LM中的四个临界点:拐点（PI）、最大加速度点（PAM）、最大减速点（PDM）和渐进减速点（PDA）,用数学语言描述了OLE对L.m.-F2365的抑菌作用发生过程。采用LM-PDA（Logistic逻辑模型PDA临界点）算法获得了新的MIC值,通过体外抑菌实验证实了,在与2倍稀释算法获得的MIC值具有相同抑菌效果（OLE抑制L.m.-F2365）的同时,可减少42.188%OLE使用量。（2）采用转录组分析技术,挖掘了在OLE作用下L.m.-F2365转录本差异表达基因。结果表明在OLE诱导（浓度设置为32 mg/m L）下,L.m.-F2365-2330（mto）基因发生了显著上调表达(FC3.5=4.10,FC24=10.72)。L.m.通常通过胞吞方式将OLE当作营养物质摄入胞内,当OLE对自身有伤害时,L.m.会通过外排泵（某种膜转运蛋白）将OLE泵出胞外以降低胞内OLE浓度,避免OLE对自身伤害。针对转运的抑菌物质不同,L.m.具有不同的膜转运蛋白。由KEGG数据库分析表明,mto基因为膜蛋白基因。本研究进一步筛选了L.m.对OLE的关键应答基因（mto基因）,并针对该基因功能展开深入研究。（3）成功制备了细胞壁残缺的L.m.-F2365的电击感受态细胞;构建并合成了g RNA的DNA转录模板,模板浓度为39.5 ng/m L,片段大小为118bp。获得了高质量的体外转录g RNA,片段大小为100 nt,总量为g RNA 35.7μg。设计特异性扩增打靶片段引物,扩增率高达82.5%。高质量制备99个打靶片段的DNA测序样品,浓度介于20～40ng/μL之间,经Agilent 2100检测,每个样品均有单一且大小为472bp的条带。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,共获得3株（28、58、89号菌株）mto基因发生沉默的单核细胞增生李斯特菌菌株,其中28号基因突变类型为无义移码突变,58和89号基因突变类型为错义移码突变,本研究中移码突变发生率为3.03%。（4）合成了C端融有His标签的mto蛋白（L.m.-F2365-2330基因翻译蛋白）,分子量为283.57 k Da,SDS-PAGE在对应位置处检测到一条清晰条带,Ni-NTA纯化后检测mto蛋白浓度为38.25±1.03 mg/m L。HPLC检测OLE中橄榄苦苷比重为18%,橄榄苦苷是OLE抑制L.m.的主要活性功能成分,OLE主要依靠橄榄苦苷行使对L.m.的抑制作用,即OLE与mto蛋白亲和程度可用橄榄苦苷与mto蛋白亲和力来表述。（5）酶标仪2倍稀释法测定3株L.m.-mto基因缺失株对OLE的MIC表型为6.4mg/m L,比L.m.野生型MIC降低了1个数量级（64 mg/m L→6.4 mg/m L）,即mto基因的缺失导致L.m.无法形成OLE外排泵（OLE膜转运蛋白）,无法将体内过量的OLE转运出胞外。（6）BLI（生物膜干涉技术）检测mto蛋白与橄榄苦苷亲和力常数（KD）均值为4.46×10-9M（皮摩级）,结合力较强。His蛋白与橄榄苦苷亲和力常数（KD）均值为5.31×10-1M（摩尔级）,结合力较弱,可扣除His标签对mto蛋白与橄榄苦苷亲和力结果的干扰。即mto蛋白与橄榄苦苷具有强亲和力,mto蛋白可特异性结合OLE（橄榄苦苷）。（7）OLE对L.m.的抑菌机制及mto基因功能研究:L.m.通过胞吞方式将OLE当作营养物质摄入胞内,当OLE到达一定浓度并对自身发生伤害时,通过mto基因产物（OLE膜运输蛋白）特异性结合橄榄苦苷（OLE）,将OLE泵出胞外以降低细胞内OLE浓度,从而避免OLE对L.m.自身的伤害。mto基因的缺失导致L.m.无法形成OLE外排泵（OLE膜运输蛋白）,无法将体内过量的OLE转运出胞外,表现出mto基因缺失时OLE对L.m.的MIC值显著下降。因此明确了mto基因为L.m.的OLE跨膜运输蛋白（OLE外排泵）基因,是L.m.耐受OLE的关键基因。综上所述,首先本研究建立LM-PDA模型,通过计算与实验相结合,将OLE对L.m.抑菌使用量降低了42.188%;然后采用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向沉默了mto基因;最后通过MIC表型法验证及BLI亲和力检测研究靶标基因功能,确认mto基因为L.m.的OLE跨膜运输蛋白（OLE外排泵）基因,是L.m.耐受OLE的关键基因,为提高OLE对L.m.抑菌效价研究提供潜在研究靶点。本研究可为OLE抑菌产品的工业生产用料轻量化提供理论依据。