综合性正畸矫治疗程一般为24～48个月。一些复杂病例可能需要更长的治疗时间。正畸矫治疗程的延长会增加牙齿脱矿、牙龈炎和牙周炎的风险。因此,如何加速牙齿移动、缩短正畸矫治疗程成为正畸医生关注的热点。牙周组织改建是牙齿移动的生物学基础。牙周组织由牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质共同构成。压力侧破骨细胞调节的骨吸收和张力侧成骨细胞调节的新骨沉积是正畸牙移动牙槽骨骨改建的基础。在正畸矫治过程中,通过牙周膜的介导作用将矫治力传导至牙槽骨,引起牙槽骨改建。在这一过程中牙周膜细胞将细胞外感受到的机械刺激转化为细胞内的生物学信号,诱导细胞产生一系列的生物学活动如细胞的增殖、分化和迁移等,进而引起牙周组织产生适应性改建。牙周膜细胞主要包括牙周膜成纤维细胞、成骨细胞、未分化的间充质干细胞以及成牙骨质细胞等。其中未分化的间充质干细胞又被称为人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs),可以分化形成牙槽骨和牙周膜样组织,具有多向分化潜能。hPDLSCs在受到机械力刺激时向成骨向分化,使牙槽骨产生适应性的应力重塑,正畸牙发生移位。促进hPDLSCs成骨向分化,加快正畸牙齿移动,缩短正畸矫治疗程成为正畸医生研究的热点。川续断皂苷Ⅵ(Asperosaponin Ⅵ,ASA Ⅵ)又称木通皂苷D,分子式是C47H76O18,是中草药川续断科植物川续断的主要活性成分。动物实验证实ASAⅥ能够增加雌性去势大鼠骨密度,具有抗骨质疏松的作用。体外实验证实,ASAⅥ能促进大鼠脂肪干细胞、大鼠成骨细胞、大鼠骨髓基质细胞和小鼠MC3T3-E1细胞系的成骨向分化。目前国内外未见关于ASA Ⅵ在hPDLSCs增殖和成骨向分化中作用的相关报道。本课题组前期研究结果表明,ASA Ⅵ可以增加大鼠正畸牙压力侧破骨细胞的数量和活性,但是对于张力侧成骨活动的影响尚不明确。进一步研究ASA Ⅵ对hPDLSCs的增殖和成骨向分化的影响及对大鼠正畸牙张力侧成骨活动的影响,有望明确ASA Ⅵ促进正畸牙移动的机制,并为探索促进正畸牙齿移动的新方法提供实验研究依据。Hippo信号通路是新发现的高度保守的信号通路,主要负责调控器官大小、细胞的自我更新和组织再生。体外研究发现,TAZ能通过与TGFβ、PPAR-γ和RUNX2等因子相互作用,进而促进干细胞成骨向分化,抑制其成脂向分化。G蛋白偶联受体30(GPR30)属于膜蛋白受体,对雌激素具有高度亲和力,是G蛋白偶联受体(GPCRs)家族的一员。GPCRs是细胞膜表面非常重要的药物作用靶点,据统计约有40%～60%的药物是以GPCRs为靶点来发挥治疗作用的。目前有多项研究证实,GPR30与骨代谢密切相关。在去势雌性大鼠模型中,GPR30的激活能显著促进骨形成,增强骨密度;当GPR30被抑制时骨形成受到抑制,骨密度降低。在大鼠成骨细胞、大鼠骨细胞、小鼠MC3T3-E1细胞系以及人牙周膜细胞中均能检测到GPR30的表达,抑制GPR30后,这些细胞的成骨活性受到抑制。细胞的增殖、分化和迁移等生物学活动通常需要多个信号通路的联合调节,单一信号通路不可能完成复杂的细胞调节功能。学者们发现G蛋白偶联受体激活后,RhoA和F-肌动蛋白被激活,Hippo通路中LATS1/2的活性被抑制,从而激活YAP/TAZ的表达。研究表明Hippo/TAZ通路在雌激素促进乳腺癌细胞增殖、迁移以及诱导乳腺肿瘤的发生中受到GPR30的调控。由此推测ASA Ⅵ作为一种植物性雌激素可能通过与GPR30结合调控细胞内Hippo/TAZ信号通路,改变相关核基因的表达,调控hPDLSCs的成骨分化。.目的本研究旨在探讨ASA Ⅵ对hPDLSCs增殖和成骨分化的影响,并探讨GPR30和Hippo/TAZ信号通路在ASA Ⅵ促进hPDLSCs成骨分化过程中的作用。最后通过将ASA Ⅵ应用于大鼠正畸牙移动模型,探讨ASA Ⅵ对正畸牙压力侧破骨活动和张力侧成骨活动的影响,为ASA Ⅵ在正畸临床的应用提供一定的理论依据。方法(1)人牙周膜干细胞的分离培养和成骨成脂分化诱导,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90、CD105 的表达。(2)CCK-8 检测 ASA Ⅵ对 hPDLSCs 增殖的影响。通过 RT-PCR 和 Western blot检测ASA Ⅵ对hPDLSCs成骨分化相关基因ALP、RUNX2和Osterix表达的影响。ALP活性、ALP染色、茜素红染色验证ASA Ⅵ对hPDLSCs成骨分化的影响。(3)通过Western blot检测ASA Ⅵ对GPR30、p-TAZ、TAZ蛋白的表达变化,探讨ASA Ⅵ对GPR30和Hippo信号通路的影响。(4)应用靶向TAZ的小干扰(siTAZ)敲低TAZ,验证TAZ在ASA Ⅵ促进hPDLSCs成骨分化过程中的作用。(5)应用靶向GPR30的小干扰(siGPR30)敲低GPR30,探讨在ASA Ⅵ促进hPDLSCs成骨分化过程中GPR30对Hippo信号通路的调控作用。(6)建立大鼠上颌第一磨牙近中移动模型,在上颌第一磨牙颊侧黏骨膜下注射ASA Ⅵ溶液,采用microCT检测牙移动距离和牙槽骨结构变化,采用RT-PCR和免疫组织化学检测张力侧RUNX2、OCN和压力侧RANKL的表达情况。采用RT-PCR和免疫组织化学分别检测张力侧和压力侧GPR30、TAZ的表达,探讨在ASA Ⅵ促进牙移动过程中GPR30和TAZ的作用。结果(1)组织块法培养出hPDLSCs,有限稀释纯化hPDLSCs,成骨成脂诱导成功,CD44、CD90和CD105呈阳性表达。CD45、CD34呈阴性表达。传代后的细胞生长状态良好。(2)一定浓度范围内的ASA Ⅵ能显著促进hPDLSCs的增殖、ALP染色、ALP活性、矿化结节形成以及成骨因子ALP、RUNX2和Osterix mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。其中,10-5M作用最为显著(P<0.05)。(3)ASA Ⅵ能显著促进GPR30和TAZ的表达,并且呈一定的时间依赖性(P<0.05)。(4)敲低TAZ后,ASA Ⅵ的促成骨作用被抑制,说明TAZ参与了 ASA Ⅵ对hPDLSCs的促成骨分化。(5)敲低GPR30后,ASA Ⅵ的促成骨作用被抑制,说明GPR30参与了ASAⅥ对hPDLSCs的促成骨分化。同时,干扰GPR30后,ASA Ⅵ诱导的LATS1/2的失活以及TAZ激活受到抑制。说明Hippo/TAZ信号通路在ASA Ⅵ促进hPDLSCs成骨分化过程中受到GPR30的调控。(6)ASA Ⅵ能加快大鼠牙移动。ASA Ⅵ通过促进RANKL表达,降低压力侧骨体积分数和牙槽骨骨密度,提高骨小梁间隙,促进压力侧骨吸收。此外,ASAⅥ通过促进OCN和RUNX2的表达刺激张力侧的骨形成,增加骨体积分数和牙槽骨骨密度,减少骨小梁间隙。在牙移动过程中ASA Ⅵ促进GPR30和TAZ的表达,说明GPR30和TAZ参与了 ASA Ⅵ促进大鼠牙移动。结论(1)ASA Ⅵ能显著促进hPDLSCs的增殖和成骨向分化,且最佳浓度为10-5M。(2)GPR30 和 Hippo/TAZ 参与了 ASA Ⅵ促进 hPDLSCs 的成骨分化。(3)Hippo/TAZ信号通路在ASA Ⅵ促进hPDLSCs成骨向分化过程中受到GPR30的调控。(4)ASA Ⅵ能够促进压力侧骨吸收,加速正畸牙移动。同时ASA Ⅵ对张力侧骨形成也有一定的促进作用。(5)GPR30和TAZ参与了 ASA Ⅵ促进大鼠正畸牙周组织改建过程。