目的:世界范围内大约有8%~12%的夫妇存在不孕不育的生育问题,其中40%~50%是由于“男性因素”导致的男性不育症,精液异常最为常见,畸形精子症至少占1/3,精子的正常形态是决定精子与卵子识别的关键,精子在体内的正常受精过程有赖于正常的精子形态。畸形精子症致病机制复杂,可能与染色体异常、基因突变或缺失,激素失调,免疫异常,感染,环境恶化,接触毒物辐射,精索静脉曲张,过量活性氧(ROS),氧化应激以及精子DNA损伤等因素有关,大多与精子的活力相结合,认为有害因素使精子表面的信号通路蛋白受体活化,通过信号转导途径改变精子结构,使精子活力和形态出现异常,其中过量ROS、氧化应激和精子DNA损伤是目前研究的热点。但究竟该过程信息通过何种信号通路的传递,目前尚无统一的认识。JAK/STAT信号转导通路是一条经典的核转录信号通路,能调节细胞生长、发育、分化、凋亡等系列生命活动。近年来发现该信号通路中的JAK2/STAT3信号通路还能通过线粒体介导氧化损伤反应,调节细胞凋亡;激活或者抑制JAK2/STAT3信号通路能调节氧化损伤反应和凋亡的过程。体外使用STAT3抑制剂作用于活动的精子,能使精子活力减弱,降低精子的受精能力,但JAK2/STAT3信号通路与精子形态和功能是否相关,改变该信号通路是否影响精子的形态和功能,目前尚不十分清楚。因此研究精子中JAK2/STAT3信号通路与精子形态和功能的关系,将有助于了解精子形态和功能异常的发生机制,有利于指导临床男性不育畸形精子症患者的治疗。我国中医药治疗不孕不育大概有2000多年历史,男性不育畸形精子症属古代“无子”范畴。导师认为该病是一种病理机制复杂的疾病,肾虚和血瘀是其重要的病理基础之一,辨为肾虚血瘀证,各种因素可致肾阳亏虚,下焦虚寒,温煦不足,精失所养或肾阴亏虚,阴虚火旺,煎熬精液,灼伤精子或者气虚无以推动血液运行,阳气亏损,无以温煦血脉,血液流动缓慢而凝滞成瘀,血流不畅易使病理产物堆积损伤精子生存的微环境,导致畸形率增高,影响精子的功能,导致不育。治疗上采用补肾活血法,拟补肾活血方治疗,以期改善精子生存的微环境、增加血液流量,对抗缺血缺氧、氧化应激,达到保护精子免受损伤而治疗畸形精子症不育的目的。本研究将采用补肾活血方治疗肾虚血瘀型男性不育畸形精子症患者,通过计算机辅助精液分析(CASA)、精子形态学染色和流式细胞技术(FCM)检测治疗前后精液常规参数、精子形态和精子DNA的完整性(精子碎片化指数,DFI)的变化,追踪其治疗后配偶的妊娠率,了解补肾活血方治疗对肾虚血瘀型男性不育畸形精子症患者精液常规参数、精子形态和精子DFI以及配偶妊娠结局的影响;采用蛋白质印迹技术(WB)检测正常精子和畸形精子症患者精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达水平,了解精子形态与JAK2/STAT3蛋白表达水平之间的关系;采用补肾活血方治疗肾虚血瘀型男性不育畸形精子症患者,分别通过CASA、精子形态学染色和WB检测治疗前后精液常规参数、精子形态和精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达水平的变化,了解补肾活血方治疗对肾虚血瘀型男性不育畸形精子症患者精液常规参数、精子形态和JAK2/STAT3蛋白表达水平的影响;最后使用不同浓度的JAK2/STAT3抑制剂(AG490)作用于正常精子,分别通过精子形态学染色和FCM检测抑制剂干预后精子形态和精子DFI的变化,了解抑制JAK2/STAT3信号通路对精子形态和精子DFI的影响,为探讨男性不育畸形精子症的发病机制和治疗途径提供科学依据。方法:本课题分为临床研究和实验研究两个方面:一、临床研究方法:收集2016年3月30日~2017年9月30日在广州中医药大学第一附属医院生殖医学科男性专科就诊的患者共60例,年龄23~45岁,诊断为男性不育症和畸形精子症,给予中医辨证为“肾虚血瘀证”者纳入为研究对象。采用随机对照原则,将研究对象分为补肾活血方组(A组)、抗氧化治疗组(B组)和不治疗组(C组)3组。A组(20例):予以补肾活血方汤剂辩证加减后口服,疗程为12周;B组(20例):予以每天口服天然维生素E 100mg,每日2次,疗程为12周;C组(20例):空白组,不予药物治疗。三组研究对象于12周(治疗)前、后采用CASA对患者精液进行精液常规参数分析,获得精子总数、精子浓度、精子总活力以及精子运动参数等;采用Diff-Quik方法检测精子形态,计算形态正常精子百分率、畸形精子百分率、畸形精子指数(TZI)、精子畸形指数(SDI)、头部缺陷百分率、颈部和中段缺陷百分率、尾部主段缺陷百分率以及过量残留胞浆百分率;采用精子密度梯度离心法提取检测精子,通过FCM检测精子DFI。12周后追踪并记录三组研究对象相应的配偶妊娠结局:包括临床妊娠率、流产率以及活胎率等。二、实验研究方法:(一)随机收集2016年3月30日~2017年9月30日在广州中医药大学第一附属医院生殖医学科男性专科就诊的患者40例,年龄23~45岁,诊断为男性不育症和畸形精子症,给予中医辨证为“肾虚血瘀证”者纳入为研究对象(畸形精子组);选择同期同年龄段在生殖医学科男性专科就诊的健康体检男性(近3个月内配偶有正常怀孕史)、精液检测正常者20例作对照(正常精子组)。两组研究对象分别采用CASA对患者精液进行精液常规参数分析,获得精子总数、精子浓度、精子总活力以及精子运动参数等;采用Diff-Quik方法检测精子形态,计算形态正常精子百分率、畸形精子百分率、畸形精子指数(TZI)、精子畸形指数(SDI)、头部缺陷百分率、颈部和中段缺陷百分率、尾部主段缺陷百分率以及过量残留胞浆百分率;采用精子密度梯度离心法提取检测精子,提取精子总蛋白,采用WB方法分别检测JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达水平。(二)随机将上述畸形精子组患者40例;分为补肾活血方组(A组)和不治疗组(B组);A组(20例):予以补肾活血方汤剂辩证加减后口服,疗程为12周;B组(20例):空白组,不予药物治疗;两组研究对象于12周(治疗)前、后采用CASA对患者精液进行精液常规参数分析,获得精子总数、精子浓度、精子总活力以及精子运动参数等;采用Diff-Quik方法检测精子形态,计算形态正常精子百分率、畸形精子百分率、畸形精子指数(TZI)、精子畸形指数(SDI)、头部缺陷百分率、颈部和中段缺陷百分率、尾部主段缺陷百分率以及过量残留胞浆百分率;采用精子密度梯度离心法提取检测精子,提取精子总蛋白,采用WB方法分别检测JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达水平。(三)随机收集2016年3月30日~2017年9月30日在广州中医药大学第一附属医院生殖医学科男性专科就诊的健康体检男性(近3个月内配偶有正常怀孕史)8例,年龄23~45岁,诊断为正常精子纳入为研究对象;常规收集精子,经密度梯度离心法处理后,将不同浓度(0、25、50、100μmol/L)JAK2/STAT3抑制剂AG490与精子在体外共孵育3小时后,分别采用Diff-Quik方法检测精子形态,计算形态正常精子百分率;通过FCM检测精子DFI。结果:一、临床研究结果:(一)补肾活血方组患者治疗后正常形态精子百分率、精子总活力、精子前向运动(PR)较治疗前升高,精子DFI、头部缺陷百分率、尾部缺陷百分率以及过量残留胞浆百分率较治疗前降低,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾活血方组患者治疗后精子畸形指数(TZI)、畸形精子指数(SDI)、颈部和中段缺陷百分率较治疗前降低,精液量、精子浓度、精子总数较治疗前升高,但差异无统计学意义(P>0.05);维生素E组患者治疗后正常形态精子百分率较治疗前升高,尾部缺陷百分率较治疗前降低,差异均有统计学意义(P<0.05);患者治疗后精子畸形指数(TZI)、畸形精子指数(SDI)、精子DFI、精液量、精子总数、头部缺陷百分率、颈部和中段缺陷百分率以及过量残留胞浆百分率较治疗前降低,精子浓度、精子总活力和精子前向运动(PR)均较治疗前升高,差异无统计学意义(P>0.05);不治疗组患者未经治疗,12周后复查尾部缺陷百分率和过量残留胞浆百分率较12周前降低,差异有统计学意义(P<0.05),正常形态精子百分率、精液量、精子总活力、头部缺陷百分率以及颈部和中段缺陷百分率升高,精子畸形指数(TZI)和畸形精子指数(SDI)无变化,精子DFI、精子浓度、精子总数和精子前向运动(PR)较治疗前降低,差异均无统计学意义(P>0.05)。(二)补肾活血方组分别与维生素E组和不治疗组相比较,补肾活血方组妊娠率和活胎率高于维生素E组和不治疗组,但差异无统计学意义(p>0.05)。二、实验研究结果:(一)JAK2蛋白和STAT3蛋白在正常精子组和畸形精子症组中均有表达;正常精子组精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达高于畸形精子症组,JAK2蛋白和STAT3蛋白表达水平在畸精子症组显著减弱,正常精子组和畸形精子症组精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达水平差异有统计学意义(p<0.05)。正常精子组和畸形精子症组中正常形态精子百分率与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达成正相关,差异有统计学意义(p<0.05);畸形精子百分率、畸形精子指数和精子畸形指数与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达成负相关,差异有统计学意义(p<0.05);头部缺陷百分率、颈部和中段缺陷百分率和尾部主段缺陷率与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达相关性不一致;过量残留胞浆百分率与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达不相关,差异无统计学意义(p>0.05)。(二)JAK2蛋白和STAT3蛋白在补肾活血方组和不治疗组均有表达;补肾活血方组JAK2蛋白和STAT3蛋白表达高于不治疗组,两组间蛋白表达水平差异统计学意义(P<0.05)。补肾活血方组和不治疗组两组患者采用自身前后对比的方式进行比较,补肾活血方组患者治疗后正常形态精子百分率、精子活力、PR、JAK2蛋白以及STAT3蛋白表达较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05);精液量、精子浓度较治疗前升高,TZI,SDI较治疗前降低,差异均无统计学意义(p≥0.05);不治疗组患者12周后正常形态精子百分率、精液量、精子浓度、精子活力、PR、TZI以及JAK2蛋白表达较治疗前升高,SDI、STAT3蛋白表达较治疗前降低,差异均无统计学意义(p≥0.05)。(三)未使用AG490孵育及使用AG490孵育精子3小时后正常形态精子百分率和精子DFI显示:精子的正常形态百分率随着AG490浓度的升高而降低,精子的DFI随着AG490的升高而升高,差异均有统计学意义(P<0.05);但正常形态精子和精子DFI两者经均数相关性分析显示没有相关性(R=0.24,P=0.14)。结论:一、补肾活血方能提高男性不育畸形精子症患者精子的正常形态精子百分率,降低精子DFI,降低精子头部缺陷百分率和尾部缺陷百分率,提高其配偶的妊娠率。二、正常精子和畸形精子症患者精子均有JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达;正常精子中JAK2/STAT3表达高于畸形精子症患者精子,精子畸形可能与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达降低有关。补肾活血方药能提高畸形精子症患者正常形态精子百分率,该过程可能与精子JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达增强,JAK2/STAT3信号通路活化有关。三、JAK2/STAT3抑制剂AG490可使体外正常精子的正常形态精子百分率降低,精子DFI升高。正常形态精子百分率降低和精子DFI升高可能与精子JAK2/STAT3信号转导通路系统受抑制有关。