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背景及目的1.Tetherin是具有特殊拓扑结构的脂筏相关跨膜蛋白,2008年发现其可抑制逆转录病毒的出芽释放,对多种包膜病毒具有潜在的抑制作用。流感病毒是有包膜的单链RNA病毒,与HIV、Ebola等包膜病毒类似,为此本研究对Tetherin基因进行了克隆及表达,并研究Tetherin的非特异性抗病毒机制及与对流感病毒复制的影响。2.有丝分裂检查站关键蛋白Zwint-1缺失不会停止正常细胞有丝分裂,却造成染色体过早的分离,引起非整倍体癌变。本实验室前期研究发现新的Zwint-1变异体(Zwint-1v)存在。本实验利用细胞周期同步化技术使HeLa细胞分别处于间期与分裂期,分析HeLa细胞不同细胞周期中Zwint-1及Zwint-1v蛋白的定位及随细胞周期变化情况。材料与方法1.提取人外周血单个核细胞RNA,RT-PCR克隆Tetherin基因,并构建其真核表达质粒。2.脂质体法在MDCK细胞中转染Tetherin表达质粒,间接免疫荧光检测Tetherin蛋白的表达及亚细胞定位。3.脂质体法转染和G418筛选稳定表达Tetherin及空载体的MDCK细胞,经流感病毒PR8感染后,利用CCK-8法测定病毒感染后细胞的增殖动力曲线,检测细胞对流感病毒的抵抗作用。4.空斑法及血凝试验及Real time PCR检测流感病毒PR8在筛选稳定表达Tetherin及空载体的MDCK细胞中的复制动力曲线。5.脂质体法转染HeLa细胞,瞬时表达Zwint-1及Zwint-1v,胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化HeLa细胞,在不同细胞周期,利用间接免疫荧光及细胞核染色检测其亚细胞定位。1.酶切及DNA测序结果表明所克隆的人Tetherin基因与GenBank序列一致,其表达质粒的构建与预期设计相符;免疫荧光结果表明其重组蛋白主要分布于细胞膜上。2.间接免疫荧光及流式检测表明成功构建稳定转染Tetherin及其空载体的MDCK细胞系。3. CCK-8检测结果表明,在感染PR8病毒后,稳定转染Tetherin的细胞活力高于空载体的细胞,感染后36h,差异有统计学意义。4.空斑实验及血凝试验结果表明,在感染各时间点,稳定转染Tetherin的MDCK细胞上清中,PR8病毒的滴度与空载体对照细胞的感染上清滴度无差异。5. Real time PCR结果显示Tetherin在24h,36h细胞内病毒含量高于空载体。6.免疫荧光结果表明,HeLa细胞间期,Zwint-1野生型定位于细胞质,Zwint-1v主要定位于细胞核;分裂期,Zwint-1及Zwint-1v大部分转移到细胞核的纺锤体及着丝粒上;Zwint-1v与Zwint定位不完全相同,且Zwint-1v更趋近于细胞核。结论1.成功克隆和表达人Tetherin基因,构建了稳定表达细胞系,重组表达Tetherin的细胞可有效抵抗流感病毒对细胞的破坏作用,并影响子代病毒的释放,初步表明人Tetherin对流感病毒具有一定的抑制作用。2.Zwint-1v在HeLa细胞中的亚细胞定位与Zwint-1野生型不同,为进一步研究Zwint-1v独特的亚细胞定位对有丝分裂检查及细胞生物学功能的影响提供研究基础。