糖尿病(diabetes mellitus)一种以慢性血糖水平增高为特征,由于胰岛素分泌或作用缺陷所致的糖、脂肪、蛋白质和水电解质异常。糖尿病的发病率在全球范围内呈现快速上升之势,其中大部分为2型糖尿病(diabetes mellitus type2, T2DM)。宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)是指由各种因素所导致的胎儿宫内生长潜能被削弱。IUGR不仅可造成胎儿窘迫、新生儿窒息和围产儿死亡,其远期危害还将延续至胎儿出生后,表现为体格、智力发育落后,成年慢性疾病(如代谢综合征)易感性增加,严重影响了人口的生存质量。已证实,IUGR是糖耐量异常和T2DM最重要的独立危险因素之一。除了先天遗传因素外,IUGR的病因很大程度上是由于孕期宫内环境(包括母体和外源环境因素)欠佳所致。已证实,一些特殊不良环境所致的IUGR存在胰腺发育损伤和p细胞数目与功能的编程改变现象,这种不可逆的变化最终可能诱发子代在生命中后期的糖耐量异常以及T2DM的风险。研究表明,IUGR宫内发育时期,胰腺β细胞数目不足和出生后富营养条件下的“追赶性生长”可以加速胰岛p细胞功能衰竭,最终导致T2DM的发生。而且,这种个体糖代谢功能的编程改变往往可能波及至多代,存在一定的跨代遗传效应(transgenerational effect)。咖啡因属黄嘌呤类生物碱,广泛存在于咖啡、茶、软饮料、食品及一些镇痛药物中。流行病学调查显示,孕期咖啡因摄入与胎儿IUGR有着十分密切的关系。本实验室前期系统证实并首次提出,孕期咖啡因暴露所致的子代IUGR及代谢综合征易感存在“神经内分泌代谢编程机制”。即：孕期咖啡因暴露可以引起胎鼠过暴露于母源性糖皮质激素(glucocorticoids, GC),进而导致胎鼠发生神经内分泌代谢发生改变：下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴功能发育抑制和外周组织局部低胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)信号通路所致的糖／脂代谢功能变化。这种神经内分泌代谢改变可一直延续至出生后,表现为HPA轴低基础活性和高应激敏感性,同时肝脏IGF-1信号通路活性增强及多组织糖／脂代谢功能改变,后者可增加成年后代谢综合征及代谢性疾病(如非酒精性单纯性脂肪肝)的易感性。上述神经内分泌代谢编程改变还具有跨代遗传效应。已知,胚胎发育时期GC可以直接影响胰腺细胞定向分化。高水平的GC干预能够导致胰腺的发育分化失衡、p细胞数目减少、胰岛素表达和分泌降低。胰腺IGF-1信号通路不仅能够促进p细胞快速分裂增殖,而且能抑制成熟的p细胞凋亡。此外,在胎胰腺发育时期,IGF-1信号通路还能通过影响胰腺前体细胞的增殖来间接影响p细胞的定向分化。提示,GC和IGF-1信号通路对胰腺的发育和p细胞数目的确定有着深远的影响。那么,孕期咖啡因暴露所致IUGR胎儿母源性GC过暴露及其对外周组织IGF-1信号通路的抑制效应是否会导致胎胰腺组织形态异常和功能分化抑制?这种宫内胰腺发育不良的IUGR子代出生后在“追赶性生长”条件下糖代谢功能是否会发生改变?这种改变是否又存在宫内编程机制和跨代遗传效应?高脂饮食能否进一步诱发糖尿病?这些问题均未见到相关报道。本研究拟首先在整体水平证实孕期咖啡因暴露所致的IUGR胎鼠存在胰腺形态发育和功能分化异常以及糖代谢表型改变,并从分子层面研究胎儿母源性GC过暴露和胰腺IGF-1信号通路抑制对胰腺发育重要基因的影响。进一步,通过观察成年子代在正常和高脂饮食下的生长发育状况和糖代谢功能改变,以期证实孕期咖啡因暴露所致IUGR子代存在糖尿病易感风险。最后,将孕期咖啡因暴露所致的IUGR子代与正常大鼠进行交配传代,确证F2代是否存在糖代谢功能改变的跨代遗传效应及其亲源性、性别差异。第一部分孕期咖啡因暴露所致的胎鼠胰腺发育不良和糖代谢表型改变及其发生机制目的：利用整体动物实验,观察孕期咖啡因暴露对IUGR胎鼠胰腺形态发育和功能分化以及糖代谢表型的影响,并探讨其可能的发生机制。方法：受孕大鼠随机分为对照组和咖啡因组。自妊娠第9日(gestational day11, GD11)起至GD20,咖啡因组于每日灌胃给予咖啡因120mg/kg.d,对照组给予同等体积蒸馏水。GD20时处死孕鼠后,剖腹取胎鼠拍照,并记录性别和体重,计算IUGR发生率。气质联用色谱法检测母、胎血中咖啡因浓度；生化技术检测母、胎血糖浓度：酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)测定胎血、胰腺组织中胰岛素原和胰岛素浓度或含量,以及胎血IGF-1浓度；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色分别观察胎胰腺组织大体形态并计算胰岛／胰腺面积比；透射电镜(transmission electron microscope, TEM)检查胰腺β细胞超微结构变化；实时定量PCR技术检测胎胰腺多个基因的mRNA表达,包括：胰腺-十二指肠同源框-1(Pdx-1)、神经元素3(neurogenin3, Ngn3)、神经分化因子1(neurogenic differentiation1,NeuroD1)、Nk6同源框-1(Nk6homeobox1, Nkx6.1)、配对框基因6(paired box,Pax6)、胰岛素基因1(insulin1,INS1)、胰岛素基因2(insulin2,INS2)、激素原转化酶1/3(prohormone convertase1/3, PC1/3)、葡萄糖转运体-2(glucose transporter2, Glut2)、葡萄糖激酶(glucokinase, Gck)、胰高血糖素样多肽受体-1(glucagon-like peptide1receptor,Glp-1r)、糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)、CCATT增强子结合蛋白a(CCATT/enhancer binding protein α,C/EBPα)、 C/EBPβ、IGF-1、IGF-1R、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate1,IRS1)、IRS2、蛋白激酶B1(protein kinase B1, Akt1)、Akt2、腺苷受体A1(adenosine receptor A1, adora1)、adora2a、adora2b;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)技术检测胎胰腺胰岛素蛋白,计算β细胞/胰腺面积比,并检测Pdx-1的蛋白表达。结果：①出生体重与IUGR率：与各自对照组相比,雄、雌胎鼠平均体重均显著性降低而IUGR率升高(P<0.01)。②血咖啡因浓度：母、胎血咖啡因浓度别为49±1μg/ml和30±31μg/ml。③糖代谢相关血表型：与对照组相比,咖啡因组母鼠血糖水平升高(P<0.01)而胎鼠血糖降低(P<0.01)；咖啡因组雄性胎鼠血胰岛素原和胰岛素水平均升高(P<0.05),雌性变化不明显；雄、雌胎血胰岛素原/胰岛素浓度比升高(P<0.05)。④组织学和超微结构：与对照组相比,咖啡因组胎胰岛小、数量少、无明显病理改变；电镜下咖啡因组p细胞内胰岛素分泌颗粒数目减少,囊泡内颗粒的膜融合和脱落现象明显。⑤胰腺形态计量和胰岛素生物合成：与各自对照组相比,咖啡因组雄、雌胎鼠胰岛总面积和p细胞总面积减少(P<0.05,P<0.01),而胰岛/胰腺面积比以及p细胞/胰腺面积比亦有降低趋势。同时,咖啡因组胎胰腺组织胰岛素原和胰岛素含量出现降低(P<0.01,P=0.06)或降低趋势。⑥胰腺功能基因的mRNA和蛋白表达：与各自对照组相比,咖啡因组胎胰腺发育级联通路(Pdx-1、Ngn3、NeuroD1、Nkx6.1和Pax-6)、胰岛素合成与修饰(INS1、INS2和PC1/3)以及分泌调控(Glut-2、Gck和Glp-lr)等重要基因的mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)或呈降低趋势。咖啡因组胎鼠Pdxl蛋白阳性染色细胞核数目减少且颜色变浅；胰岛素阳性染色较浅且对应区域所占胰岛面积比例减少。⑦胎胰腺GC功能相关基因mRNA表达：与各自对照组相比,咖啡因组胎胰腺GR和C/EBPα表达升高(P<0.01),而C/EBPβ降低(P<0.01)。⑧血IGF-1及胰腺IGF-1通路基因表达：与各自对照组相比,咖啡因组胎鼠血IGF-1水平降低,尤以雌性显著(P<0.05)；雌性IGF-1通路(IGF-1R、IRS1和IRS2)表达降低(P<0.05,P<0.01),但雄性变化不显著。⑨胰腺腺苷受体mRNA表达：与各自对照组相比,咖啡因组雄性Adora1、Adora2b表达升高(P<0.05,P<0.01),而adora2a无改变；雌性所有腺苷受体表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论：孕期咖啡因暴露导致IUGR胎鼠胰腺发育不良和糖代谢表型改变,其发生机制一方面与咖啡因所致“宫内母源性GC过暴露”对胰腺发育和功能分化基因的直接抑制以及通过C/EBPs下调胰腺IGF-1信号通路的间接作用有关,另一方面也受腺苷受体介导的咖啡因刺激胰岛素过度释放的影响。第二部分孕期咖啡因暴露所致成年子代大鼠糖代谢功能改变和糖尿病样反应目的：在整体水平,观察和比较孕期咖啡因暴露所致IUGR子代出生后在正常和高脂饮食下的生长状况以及成年后的胰腺形态、糖代谢表型和功能改变,并结合肝脏胰岛素信号通路表达变化分析其可能的原因。方法：第一批动物：孕鼠及处理方式基本同第一部分。待孕鼠自然生产后,所有子代采用正常饮食饲养。出生后第20周(postnatal week20,PW20)时进行腹腔注射糖耐量实验(intra-peritoneal glucose tolerance test,IPGTT),PW21时进行胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT),第二批动物：处理方式同第一批动物,但采用高脂饮食饲养。PW20时进行口服糖耐量实验(oral glucose tolerance test,OGTT)。追踪两批动物出生后体重变化并计算体重增长率,PW24时处死后收集肝脏和胰腺组织。生化技术和放免法检测血糖和胰岛素含量；HE染色和TEM观察胰腺组织形态和超微结构改变；胰岛素免疫组化计算β细胞／胰腺面积比例；实时定量PCR技术检测肝脏胰岛素受体(insulin receptor,IR)、IRS2和Glut2的mRNA表达。结果：(1)正常饮食饲养子代：①体重及体重增长率：与各自对照组相比,咖啡因组雄、雌子代PW1时体重显著降低(P<0.01)；断奶后(PW4)至PW24时段内绝对体重较低(P<0.05,P<0.01),但体重增长率升高(P<0.05,P<0.01)。②IPGTT:与各自对照组相比,咖啡因组雄、雌子代基础(0min)血糖和胰岛素以及定量胰岛素敏感性检测指数(quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI)无明显变化。给予糖负荷后,咖啡因组雌性120min血糖值明显降低(P<0.01)且曲线下面积(area under the curve, AUC)减少,雄性变化不显著。咖啡因组雌性15mmin血胰岛素水平明显升高(P<0.05)。对照和雌性咖啡因组15min血胰岛素水平较0min升高(P<0.05,P<0.01)。进一步,将各时间点血糖和胰岛素水平按0min值进行标准化后发现,咖啡因组各时间点相对血糖和胰岛素与绝对血糖和血胰岛素水平变化趋势基本一致。③ITT：与各自对照组相比,咖啡因组雄、雌子代给予胰岛素后60、120min时血糖百分比及AUC降低(P<0.05,P<0.01)。④胰腺组织学和超微结构：咖啡因组雄、雌子代大鼠胰岛形态与对照相比无改变；咖啡因组胰岛p细胞出现线粒体水肿,雄性存在核仁边集而雌性则有高尔基体肥大现象。④胰腺p细胞比例：与对照组相比,咖啡因组雄、雌子代胰岛细胞／胰腺面积比例有降低趋势。⑤肝脏胰岛素信号通路mRNA表达：与各自对照组相比,仅咖啡因组雌性子代肝脏IR、IRS2和Glut2的mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。(2)高脂饮食饲养子代：①体重及体重增长率：与对照组相比,咖啡因组子代PW1时体重降低(P<0.01);PW4-PW24时,尽管咖啡因组雄性子代体重较低(P<0.01,P<0.05),但雌性体重与对照持平,对应体重增长率均显著升高(P<0.01,P<0.05)。②OGTT:与对照组相比,咖啡因组子代基础(0min)血糖升高而血胰岛素降低,对应QUICKI升高,以雌性明显(P<0.01)。给予糖负荷后,咖啡因组雄性120min血糖升高(P<0.01)但AUC变化不明显；雌性血糖峰值和AUC均显著性升高(P<0.01)。咖啡因组子代各时间点胰岛素水平和AUC降低,以雌性明显(P<0.05,P<0.01)。将各时间点血糖和胰岛素按0min值进行标准化后,与对照组相比,雌性各时间点相对血糖值和AUC呈现与绝对值变化相反的降低趋势。③胰腺组织学：与高脂饮食对照组相比,咖啡因组子代胰岛出现严重脂肪空泡变性。④肝脏胰岛素信号通路mRNA表达：与各自对照组相比,仅咖啡因组雌性子代肝脏胰岛素信号通路关键基因IR、IRS2和Glut2的mRNA表达升高(P<0.01)。结论：孕期咖啡因暴露所致的IUGR成年子代在正常饮食下出现血糖代谢表型正常但糖耐量增强和胰岛素敏感性增加。进一步在高脂饮食诱导下,出现胰腺损伤加重引起的“高血糖、低血胰岛素”表型并伴有糖代谢能力相对增强的糖尿病样反应,尤以雌性明显。第三部分孕期咖啡因暴露所致子代大鼠糖代谢功能改变的跨代遗传效应目的：在整体水平,分别观察孕期咖啡因暴露所致F2代宫内和成年时期的糖代谢表型变化和糖代谢功能的改变,探讨孕期咖啡因暴露所致子代大鼠糖代谢功能改变的跨代遗传效应及其特征。方法：孕鼠处理同第一部分。待孕鼠自然生产后,所有F1子代采用正常饮食饲养。PW16时,将F1代对照与咖啡因组大鼠按照雄性对照-雌性对照(control-control, CC)、雄性咖啡因-雌性对照(caffeine-control, CaC)、雄性对照-雌性咖啡因(control-caffeine, CCa)和雄性咖啡因-雌性咖啡因(caffeine-caffeine, CaCa)四种方式分组并交配得到F2代。一部分孕鼠于GD20日处死并剖腹取F2代胎鼠,记录胎鼠体重并收集胎血。另一部分孕鼠自然生产,所得F2代仔鼠给予正常饮食饲养,追踪体重变化并计算体重增长率。PW20时行IPGTT, PW21时行ITT。PW24时处死并收集血清。ELISA检测血清皮质酮(corticosterone,CORT)和胰岛素浓度,生化技术检测血糖浓度。结果：①体重及体重增长率：与各自CC组相比,CaC组雌性胎鼠GD20体重有升高趋势；CCa和CaCa组则有降低趋势。PW4-PW16时间段内,CCa组雌性和CaCa组雄、雌子代整体体重变化均低于相应的CC组(P<0.01,P<0.05)。②血糖代谢表型：与各自CC组相比,CaC和CaCa组胎鼠血糖水平升高,以CaC组显著(P<0.01),而CCa组降低(P<0.01,P<0.05)。咖啡因组雄性胎鼠血胰岛素水平降低,以CaC和CCa组明显(P<0.01)；对于雌性,CaC和CaCa组血胰岛素均升高(P<0.05)而CCa组降低(P<0.05)。PW24时,与CC组相比,咖啡因组成年子代血CORT水平升高,以CCa组雄性、CaC和CaCa组雌性子代明显(P<0.05)。CaC和CCa组雄、雌子代血糖浓度均不同程度升高(P<0.01),CaCa组雄性血糖浓度降低而雌性无改变。咖啡因组成年雄性F2代血胰岛素浓度均升高(P<0.05),CaC和CaCa组雌性血胰岛素浓度有降低趋势。③糖耐量：对于雄性F2代,与CC组相比,给予糖负荷后,CaC组120min血糖浓度升高(P<0.05)且曲线AUC呈升高趋势；CCa组15、30min血糖浓度和AUC有降低趋势；CaCa组30、60min血糖浓度和AUC降低(P<0.05,P<0.01)。对于雌性F2代,与CC组相比,CaC组0min血糖浓度显著性升高(P<0.05),给予糖负荷后15、30min血糖浓度和AUC降低(P<0.05,P<0.01); CCa和CaCa组各时间点(除120min)血糖浓度下降且AUC减少(P<0.05,P<0.01)。将IPGTT各时间点血糖水平按0min值进行标准化后,与各自CC组相比,咖啡因组雄、雌F2代各时间点相对血糖和曲线AUC变化趋势与标准化前的结果保持一致。④ITT：对于雄性F2代,与CC组相比,给予胰岛素后,CCa组30、60min血糖浓度百分比和AUC升高(P<0.05)；CaCa组15min血糖浓度百分比降低(P<0.01)。对于雌性F2代,与CC组相比,给予胰岛素后,CaC和CaCa组大部分时间点血糖浓度百分比和AUC有升高趋势；CCa组AUC有降低趋势。结论：孕期咖啡因暴露对子代生长发育的抑制存在跨代遗传效应。同时,咖啡因所致IUGR子代大鼠糖代谢功能异常可延续到F2代,表现为与F1代相同的糖耐量增强以及与之相反的胰岛素敏感性降低,而且具有一定的亲源性和性别差异特征。