烟草靶斑病(tobacco target spot)是近年来我国新报道的一种烟草叶部病害,危害严重,该病害对烟草的产量和品质有显著的影响,但是国内缺乏文献记载。鉴于此,本文针对烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)的遗传分化、侵染特性和致病机理进行了系统研究,研究结果如下：1.首次明确了我国烟草靶斑病菌的菌丝融合群为AG-3,以及病菌的致病类型,即强致病类型、中等致病类型和弱致病类型。对采自辽宁各地区的58个烟草靶斑病菌菌株进行了融合群测定,确定在我国引起烟草靶斑病的立枯丝核菌属于AG-3融合群；并对病菌的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列进行了分析,通过GenBank进行序列同源性比对,结果表明,病菌的rDNA ITS序列长度为653bp,其与引起番茄叶部病害的立枯丝核菌(AG-3融合群)的ITS序列的同源性高达100%,从分子水平上也证明了烟草靶斑病菌属于AG-3融合群,从形态学和分子水平上对烟草靶斑病菌进行了准确的分类鉴定；并从中选出16个有代表性的烟草靶斑病菌菌株进行了致病力测定,根据供试菌株在烟草品种NC89、K326、云烟85和G80的抗感反应,可将这16个菌株划分为3个致病类型,即强致病类型、中等致病类型和弱致病类型,表明我国烟草靶斑病菌的致病力存在明显分化,但致病类型的分布与菌株的地理来源无明显的相关性。2.应用RAPD和ISSR两种分子标记方法对我国烟草靶斑病菌进行遗传多样性分析,从分子水平探索烟草靶斑病菌的遗传演变和进化,并系统分析了RAPD和ISSR分组与菌株的地理来源和致病性的相互关系。利用优化的反应体系,筛选出9条RAPD引物和7条ISSR引物分别对供试的16个烟草靶斑病菌菌株进行扩增,分别扩增出111和83条带,多态条带比率分别为64.86%和68.67%；RAPD标记的菌株间的相似系数范围分别为0.63-0.93,在相似系数0.74处被划分成3个类群,ISSR标记的菌株间的相似系数范围分别为0.61-0.94,在相似系数0.75处被划分为3个类群。RAPD和ISSR分析结果均表明,我国烟草靶斑病菌群体具有丰富的遗传多样性和明显的遗传分化现象,遗传聚类组群与烟草靶斑病菌菌株的地理来源具有一定的相关性,而与菌株的致病性无明显的相关性。并利用RAPD和ISSR方法对烟草靶斑病菌菌株和引起其它病害的立枯丝核菌菌株进行了遗传多样性分析,结果表明,烟草靶斑病菌菌株间的亲缘关系最近,而与引起其它病害的立枯丝核菌菌株的亲缘关系较远,它们之间存在较大的遗传差异。3.研究了烟草靶斑病菌的侵染特性,并首次明确了烟草靶斑病菌与重要病菌如水稻纹枯病菌和玉米纹枯病菌的交互致病性。研究结果表明,烟草靶斑病菌以菌丝体或菌丝体随病残体在土壤中越冬,或菌丝体在病残体中越冬；病菌可通过烟草叶片气孔和伤口侵入,伤口更有利于病菌侵入；病菌可侵染烟草苗期和成株期的茎部,引起烟草立枯病和茎基腐病,病菌也可以侵染烟草叶片的主脉和侧脉。对病菌的侵染过程进行观察,发现病菌在接种24h时开始侵入烟草叶片组织,接种24～48h内菌丝迅速在细胞间和细胞内扩展,受侵细胞被破坏,最终死亡。确定了病菌适宜的侵染条件,最适温度为25～30℃；保湿和接种时间越长越有利于发病；12h光照12h黑暗和连续黑暗的条件对病菌的侵染有利,而连续光照对其有明显的抑制作用。对20个烟草品种的抗性研究发现,VRG2最为抗病,发病率为25%。寄主范围测定结果表明,烟草靶斑病菌可侵染烟草、番茄、茄子、辣椒、黄瓜、冬瓜和苋色藜,其中茄子的发病率最高为97.5%。交互致病性测定结果表明,烟草靶斑病菌不能侵染水稻、玉米和白菜,但水稻纹枯病菌、玉米纹枯病菌、白菜丝核菌叶腐病菌、烟草立枯病菌和烟草茎基腐病菌均能侵染烟草叶片。通过田间试验,对该病害进行损失估计,统计结果表明产量损失率和产值损失率与病级均呈显著的正相关,病级越高,产量和产值损失越大,并建立了关系模型。选用10种药剂对烟草靶斑病菌进行室内抑菌试验,建立了各药剂的毒力回归方程并计算出EC50,结果表明,烯唑醇、菌核净、嘧肽菌净、退菌特和代森锰锌对该病菌具有较强的抑制作用,可作为防治该病害的首选药剂。4.明确了烟草靶斑病菌产生的毒素的基本性质及其致病机理。试验通过活性炭吸附、甲醇洗脱、旋转蒸发浓缩的方法,从烟草靶斑病菌的Richard培养滤液中获得了黄褐色粗毒素,该毒素能够使烟草叶片产生与靶斑病类似的病斑,而且还能抑制种子萌发和胚根生长,导致幼苗萎蔫。明确了病菌产毒的最佳培养条件,即pH值6～7的Richard培养液,温度25℃,黑暗每12h振荡1次条件下培养15～20d。对毒素的基本性质进行研究,结果表明该毒素具有热稳定性、光稳定性和耐储藏性,它是一类易溶于水的非蛋白类的极性物质。研究探讨了毒素对烟苗叶片组织中的抗性相关生理生化指标的影响,结果表明,毒素可激活烟草叶片中POD、PPO、CAT和PAL活性,而抑制SOD活性,受害叶片的叶绿素和可溶性糖含量显著下降,而可溶性蛋白、丙二醛和游离脯氨酸含量明显升高,组织浸出液的相对电导率也显著升高,这些指标的变化表明了毒素对烟草有明显的毒害作用,同时也表明了毒素可引起烟草体内的防御反应,以抵抗毒素造成的伤害。不同致病力烟草靶斑病菌菌株的产毒素能力也不同,强致病力菌株YC-9的产毒能力比弱致病力菌株LF-1强。5.明确了烟草靶斑病菌产生的细胞壁降解酶的致病机理,强致病力菌株的产酶能力显著高于弱致病力菌株。烟草靶斑病菌在人工Marcus培养液中能产生果胶酶(PG、PMG、PGTE、PMTE)和纤维素酶(Cx、β-葡萄糖苷酶),其中PG活性最高。明确了最佳产酶条件,Cx和β-葡萄糖苷酶的最适培养时间为10d,而PG、PMG、PGTE和PMTE为12d；培养最适温度为25℃；Cx、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG的最适pH值为5,而PGTE和PMTE的最适pH值为6；静置培养和连续黑暗条件利于酶的产生。烟草叶片不同病斑部位酶活性不同,其中病健交界处细胞壁降解酶活性最高。烟草靶斑病菌与烟草互作过程中细胞壁降解酶活性测定结果表明,病菌侵染叶片后,PG、PMG. PMTE、PGTE、Cx、β-葡萄糖苷酶活性均显著升高,其中Cx和β-葡萄糖苷酶活性最高,其次为PG和PMG,而PMTE和PGTE活性很低。病菌产生的细胞壁降解酶液能够使烟草叶片产生病斑,混合酶对叶片的损伤作用明显高于单一酶,果胶酶的损伤作用高于纤维素酶。对不同致病力烟草靶斑病菌菌株的产酶能力进行比较,结果表明强致病力菌株YC-9的产酶能力显著高于弱致病力菌株LF-1。6.通过同源获取基因中间片段和RACE方法克隆得到一个与烟草靶斑病菌致病性相关的基因,即病菌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)基因。病菌endo-PG基因的cDNA全长序列为1399 bp, CDS区长1086 bp,编码361个氨基酸。