论文部分内容阅读
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种危害严重的人畜共患传染病病原。JEV经蚊虫传播,主要侵害中枢神经系统并引发脑炎,但JEV复制和致病机理仍待深入解析。NS3蛋白是JEV的一种重要非结构蛋白,具有丝氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性和核苷5’三磷酸酶(ATP酶)活性,在JEV复制和致病过程中发挥重要作用。深入研究JEV NS3蛋白与宿主蛋白的相互作用对于深入分析NS3蛋白功能、解析JEV复制和致病机理、开发新型抗病毒药物具有重要科学意义。本研究在真核细胞环境中筛选、鉴定了可能与JEV NS3互作的宿主蛋白,并对其相互作用的分子机制和功能作用进行深入分析,具体内容如下:1.JEV NS3单克隆抗体的制备使用纯化的JEV NS3原核表达蛋白免疫4-6周龄的Balb/C小鼠,通过细胞融合和4次亚克隆,最终得到2株能够稳定分泌NS3抗体的杂交瘤细胞株:1H7和2D4。通过Western blot和间接免疫荧光实验分析验证,所得到的这两株单抗均具有很好的特异性。2.与JEV NS3蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定利用串联亲和纯化(TAP)结合质谱分析的方法,在HEK293T细胞中筛选到3个可能与JEV NS3发生相互作用的宿主蛋白:核糖体小亚基蛋白11(RPS11)、腺嘌呤核苷酸转运蛋白2(ANT2)和真核翻译延伸因子(EEF1A1),并通过免疫共沉淀对它们的相互作用进行了验证。3.JEV NS3蛋白与EEF1A1相互作用及其对JEV复制的影响利用IP-RT PCR的方法,发现EEF1A1可以和JEV复制复合体的主要组成成分NS3、NS5及基因组发生相互作用,荧光共聚焦显微镜显示EEF1A1可以和JEV NS3、NS5及病毒的双链RNA(dsRNA)发生共定位。病毒增殖实验表明EEF1A1可以正调控JEV的复制。进一步分析发现EEF1A1可以通过其分子伴侣样的活性降低宿主蛋白酶体对JEV NS3和NS5的降解作用,从而稳定病毒复制复合体的主要组成成分,促进JEV的复制。4.JEV通过miR-33a-5p调控EEF1A1的表达及病毒复制荧光定量PCR和Western blot验证了JEV感染可上调EEF1A1的表达。进一步研究发现JEV感染可以诱导宿主miR-33a-5p的表达下调,而miR-33a-5p则可通过靶向EEF1A1,调控EEF1A1的表达,并进而调控JEV的复制。并且,我们还发现JEV感染可以通过抑制miR-33a-5p宿主基因SREBP2的转录因子NF-Y和sp1的活性,从而在转录水平上调控miR-33a-5p的表达。本研究首次通过TAP的方法发现了三个与JEV NS3相互作用的宿主蛋白:RPS11、ANT2和EEF1A1,并对EEF1A1与NS3相互作用的功能进行了深入分析,揭示了EEF1A1在JEV复制过程中的作用机制,同时阐明了JEV调控EEF1A1表达的分子机制。以上结果,有助于我们更加深入的了解JEV的复制机理,同时也为抗JEV新型药物研发提供了重要科学线索。