研究背景 结核病一直是威胁人类健康的严重疾病。尤其在发展中国家，尽管不同程度地推行现代结核病控制策略，但是结核病疫情下降缓慢。目前我国约有活动性肺结核病人451万，涂阳肺结核病人150万，菌阳肺结核病人196万。从估算的病例数来看，近10年来，活动性肺结核病人减少了约25％。全人口的结核感染率为44.5％，也就是说我国有近半的人口(约5.5亿人)感染了结核杆菌，0-14岁儿童的结核感染率为9.0％。每年约有13万人死于结核病，结核病死亡仍然是其他各种传染病和寄生虫病死亡总和的2倍，结核病死亡平均年龄为55.2岁。 近20年来全球HIV/AIDS的流行加剧了结核病的疫情，结核病与HIV/AIDS的共同感染使人类面临更加严峻的挑战。结核病与HIV是潜伏感染期互相激活的危险因素，二者之间具有互相促进的协同作用，一方增强另一方的进展。一方面，受HIV感染后，免疫功能缺陷无力阻止结核分枝杆菌的生长和局部播散，使结核病成为HIV感染者中最常见的机会性感染和死亡的主要原因。另一方面，受结核分枝杆菌感染后，其肉芽肿内活化的巨噬细胞所产生的TNF-α(肿瘤坏死因子-α)可激活HIV的繁殖，加速其发展成为艾滋病。 卡介苗已经使用将近100年，它对结核病的保护性作用是有限的。卡介苗能够减少婴幼儿的结核病发病率和死亡率，尤其减少粟粒性结核与结核性脑膜炎的发生，但对成人肺结核和肺外结核而言作用甚微，而成人肺结核是造成结核病死亡的主要原因，也是结核病的唯一传染源。因此，发展具有流行病学作用的新疫苗是控制结核病的首要任务之一。 抗原85A是分枝杆菌分泌到细胞外的主要蛋白质，有分泌型和成熟型两种形式，成熟型存在于分枝杆菌细胞培养滤液中，分泌型存在于细胞内，包括成熟蛋白和一段信号肽。大量研究表明，Ag85A是分枝杆菌的主要保护性抗原之一。Ag85A的蛋白质疫苗、DNA疫苗或表达Ag85A的重组病毒、BCG疫苗均能诱导机体免疫应答，并能抵抗结核分枝杆菌的侵袭。 植物组织内表达抗原作为一种新兴的疫苗生产方法，近年来受到研究者们的重视。很多临床前动物实验和一些人体实验显示，植物组织细胞中表达的抗原蛋白质能组装成正确的空间结构，进行免疫接种后能诱导机体产生免疫反应并具有一定的保护作用。 因此，该研究选择分泌型Ag85A的完整编码基因fbpA为外源目的基因，进行黄樱桃番茄遗传转化，对其在番茄组织中的表达进行初步研究，为进一步深入探索结核病植物疫苗奠定基础。 材料与方法 用PCR方法从卡介苗D2株基因组DNA中分离目的基因fbpA，经过纯化回收将其与克隆载体pUCm-T重组，得到重组体pUCm-T-fbpA后，转入感受态大肠杆菌DH5α中，对转化子和重组体进行单菌落PCR、HindⅢ单酶切、BamHI+SacⅠ双酶切以及DNA序列分析等鉴定。经鉴定证实fbpA基因正确无误后，从重组体pUCm-T-fbpA中用BamHⅠ+SacⅠ双酶切下目的基因fbpA，与用相同双酶切的植物表达载体pBI121在体外重组以获得重组体pBI121-fbpA，将重组体转入大肠杆菌DH5α细胞株中进行鉴定，经过单菌落PCR、BamHⅠ+SacⅠ双酶切鉴定证实重组正确后，将重组质粒pBI121-fbpA转入土壤根癌农杆菌EHA105细胞株中，经过单菌落PCR、从转化子EHA105中提取重组质粒pBI121-fbpA扩增目的基因等步骤鉴定证实转化正确后，将携带重组体pBI121-fbpA的农杆菌株EHA105保存，以备在植物基因转化过程中使用。 选取番茄栽培品种红樱桃与黄樱桃子叶和下胚轴进行离体组织培养，以MS培养基作为基本培养基，附加不同浓度的细胞分裂素ZT和生长素IAA，共组成四组培养基进行愈伤组织与芽诱导分化实验。对选出的最佳外植体(黄樱桃番茄子叶)分别进行卡那霉素、羧苄青霉素和头孢霉素敏感性实验。然后，用携带重组质粒pBI121-fbpA的农杆菌株EHA105悬浮培养液侵染预培养2天的子叶，菌液OD600约0.3左右，侵染10分钟。接着在黑暗条件下将侵染过农杆菌的子叶共培养3天(在农杆菌增殖阶段向YEB培养基中添加200uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖，在侵染子叶以及共培养阶段向MS培养基中添加20uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖)。然后，转移子叶到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L羧苄青霉素的培养基上进行选择、抑菌培养。待不定芽分化出后切下转移到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的生根培养基上培养。待根分化生长后，经过一段时间炼苗，将转化植株逐步从培养室移至普通实验室，再到室外，最后移栽大田。 取少量转化植株幼叶直接裂解后用上清液作模板对目的基因进行扩增。然后再提取转化植株总DNA进行PCR分析、Southern印迹杂交分析，判断外源目的基因fbpA是否整合到黄樱桃番茄染色体DNA中。对经过上述鉴定的阳性植株提取果实总蛋白质，用Western印迹杂交分析fbpA基因在番茄组织中的表达。 结果 DNA序列分析显示，fbpA基因有一个开放阅读框，共有1014个碱基组成，上游是一段信号肽编码区域，碱基数为129个，推测为43个氨基酸编码，下游是Ag85A成熟蛋白质编码区域，碱基数为885个，推测为295个氨基酸编码。fbpA基因在卡介苗D2株与1173P2株中的同源性为100％。对重组体pUCm-T-fbpA和DH5α转化子、重组体pBI121-fbpA和DH5α/EHA105转化子进行的鉴定均证实fpbA基因克隆与转化正确。 黄樱桃番茄与红樱桃番茄的子叶、下胚轴在四组培养基中经过离体组织培养后发现，只有黄樱桃番茄子叶的再生频率最高，出芽率达到100％，平均11天分化出不定芽，最佳培养基配方为附加1mg/LZT和0.8mg/LIAA的MS培养基。黄樱桃番茄子叶在卡那霉素选择培养基中生长明显受到抑制，出愈率和出芽率显著下降，而出愈时间和出芽时间明显延长，当卡那霉素浓度达到10mg/L时完全抑制子叶分化。因此，以10mg/L卡那霉素作为外源目的基因转化后的选择压。0-500mg/L羧苄青霉素对子叶分化没有明显影响，但是却明显抑制根生长，而相同浓度的头孢霉素对根的分化与生长都没有明显影响。因此，在抑菌培养阶段，芽分化期宜用500mg/L羧苄青霉素，根分化生长期宜用500mg/L头孢霉素。 子叶侵染、共培养转化后转移到附加10mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的MS培养基中进行选择、抑菌培养时观察到，转化愈伤组织与转化不定芽生长缓慢、数量显著下降，每个外植体上最多只分化出1个不定芽。在未添加乙酰丁香酮和葡萄糖的对照组，转化芽率约6.2％，而在添加了这两种物质的处理组，转化芽率显著提高，达到13.1％。将转化芽移到10mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS生根培养基中诱导根分化生长，观察到根生长缓慢，根数少。待根长出后即移到无抗生素的培养基中促进转化植株生长，最后移栽大田。 对转化植株进行分子检测与鉴定的结果显示，fbpA基因整合入黄樱桃番茄染色体DNA中，在番茄果实中表达的蛋白质Ag85A能被结核病人的血清识别。 结论 1.卡介苗D2株编码分泌型抗原85A的基因fpbA与1173P2株的该基因同源性为100％。 2.黄樱桃番茄子叶是优良的外源基因转化的受体材料。 3.转化后选择、抑菌培养阶段卡那霉素选择压以10mg/L为宜，芽分化期羧苄青霉素以500mg/L为宜，根分化生长期头孢霉素以500mg/L宜。 4.乙酰丁香酮与葡萄糖可以显著提高转化芽率。 5.fbpA基因在黄樱桃番茄染色体DNA中发生整合，其在番茄果实中的表达产物分泌型抗原85A可以被结核病人的血清识别。