背景/目的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是全球危害人类健康的公共卫生问题,具有高发病率、高致残率、高医疗费用、低知晓率的流行病学特点。心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性肾脏病(CKD)最主要的并发症,也是CKD患者最主要的死亡原因,其死亡率约占慢性肾脏病患者总死亡率的44%～51%。心血管疾病的传统危险因素不足以解释CKD患者心血管事件高发的原因,因此,其他非传统危险因素如内皮细胞功能紊乱引起了许多学者的重视。内皮细胞功能紊乱是心血管事件的起始因素,且临床及实验研究均证实,血管内皮细胞功能的改变与慢性肾脏病的发生和发展密切相关。因此,寻找CKD患者血管内皮功能紊乱的影响因素并深入研究内皮细胞功能紊乱的发生机制、早期准确地对CKD患者血管内皮功能进行检测评估,对CKD患者心血管疾病的诊断、治疗及预后具有重要意义。瘦素是一种脂肪细胞因子。以往研究认为,瘦素主要在调节机体摄食和能量代谢中发挥重要作用。随着研究的深入,瘦素在神经内分泌、血管新生、生殖发育、免疫调节和创伤修复等方面的作用也逐渐被人们认识。近年来大量临床研究显示,血清瘦素水平与心血管疾病的发生密切相关,而且体外实验也提示瘦素可以诱导高血压及蛋白尿的发生,并可促进动脉粥样硬化的发生发展。肾脏是瘦素清除的主要器官,已有研究表明,瘦素在慢性肾脏病患者血清中的浓度升高。然而,关于瘦素与慢性肾脏病的关系,特别是瘦素对慢性肾脏病患者内皮功能紊乱的影响的相关研究甚少。因此,本研究旨在评估慢性肾脏病患者的血清瘦素水平以及血管内皮的功能状态,分析CKD患者血清瘦素水平与内皮功能障碍的关系,并通过体外实验验证瘦素对内皮细胞功能改变的影响,探讨其作用的可能的分子学机制,从而为理解慢性肾脏病患者心血管事件的高发病率、改善CKD预后提供新的思路,并为进一步研究有效干预和治疗CKD患者内皮功能障碍提供新的理论依据。研究方法本研究分为临床研究和体外细胞实验两部分,分别完成慢性肾脏病患者血清瘦素水平与内皮功能紊乱的相关性分析及瘦素诱导内皮细胞功能紊乱的分子机制研究。1临床研究本研究共纳入140例临床病情稳定的成人非糖尿病性CKD病人及140例性别、年龄匹配的健康成年人,收集所有研究对象的性别、年龄、身高、体重、血压等基本资料及血脂、血糖、肝肾功能、超敏C反应蛋白等实验室指标,并采集空腹血标本,通过ELISA检测研究对象血清瘦素含量以及内皮功能紊乱的血清学指标sICAM-1和sVCAM-1的浓度。采用无创超声测定右肱动脉血流介导的血管舒张功能(flow-mediated dilation,FMD)进一步评估46例病人及30例健康人的血管内皮功能,该指标用肱动脉直径的舒张百分比表示。采用SPSS软件对临床资料进行统计学分析,比较两组间同一指标的差异,并采用Spearman相关来分析CKD病人两个变量之间的相关性,借此探讨慢性肾脏病患者血清瘦素水平变化及其与内皮功能状态的关系。双侧P值<0.05定义为有显著统计学差异。2体外实验2.1瘦素对HUVECs黏附分子合成的影响:体外培养脐静脉内皮细胞,使用瘦素(100 ng/ml)刺激HUVECs不同时间,收集HUVECs上清,离心后采用ELISA检测上清液中可溶性ICAM-1、VCAM-1的水平,并以此确定后续实验中瘦素对HUVECs的刺激时间;瘦素(100 ng/ml)刺激HUVECs 24小时后,分别采用western blot和实时荧光定量PCR检测ICAM-1、VCAM-1在蛋白质水平及mRNA水平的表达。2.2瘦素对内皮细胞迁移的影响:同时采用Transwell(聚碳酯膜,滤膜孔径:8.0 μm)迁移实验及划痕实验检测瘦素对HUVECs活动力的影响。2.3瘦素对内皮细胞单层通透性的影响:Transwell上室(聚酯膜,滤膜孔径:0.4 μm)培养HUVECs形成内皮细胞单层,通过检测内皮单层对FITC-dextan的通透性,探索瘦素对内皮细胞单层通透性的影响。2.4瘦素对内皮细胞骨架重排的影响:免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察瘦素刺激下脐静脉内皮细胞细胞骨架蛋白F-actin和vinculin的变化。2.5瘦素诱导内皮功能紊乱的分子机制:western blot检测瘦素处理后AKT/GSK3β通路的活性变化及其对β-catenin信号的影响,包括AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表达情况;β-catenin总蛋白和核蛋白的表达变化。为验证AKT及β-catenin信号通路在瘦素诱导的内皮细胞功能紊乱中的作用,我们进一步构建了 AKTshRNA质粒及β-cateninshRNA慢病毒,并分别转染细胞,检测AKT或β-catenin基因敲除后瘦素刺激下黏附分子的表达、内皮细胞迁移及通透性的改变,以及细胞骨架重排的变化。结果1临床研究1.1与健康人相比,慢性肾脏病患者血清瘦素水平明显升高(P=0.006)。1.2与健康人相比,慢性肾脏病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平升高,FMD水平明显减低(median(Q1,Q3),4.3(2.1-6.4)in patients vs.6.4(2.4-12.5)in controls,P<0.05)。1.3 Spearman相关性分析显示,慢性肾脏病患者血清瘦素水平与sICAM-1、sVCAM-1 浓度均呈正相关(sICAM-1:r=0.194,P=0.019;sVCAM-1:r=0.183,P=0.027);在进行了 FMD测量的46例CKD患者中,血清瘦素水平与FMD呈显著负相关(r=-0.418,P=0.004)。2体外实验2.1瘦素可诱导人脐静脉内皮细胞黏附分子合成增加:以瘦素刺激脐静脉内皮细胞6,12,24及48小时,与对照组相比,上清液中sICAM-1及sVCAM-1水平在12小时即可见升高,24小时后达到最明显作用,差异有统计学意义。而且,瘦素刺激脐静脉内皮细胞24小时后,脐静脉内皮细胞ICAM-1和VCAM-1总蛋白及mRNA的表达均明显增加,差异均有统计学意义。2.2瘦素可促进内皮细胞迁移:与正常对照组相比,瘦素刺激组划痕愈合速度较快,迁移穿过Transwell膜的细胞数多,差异均有统计学意义。2.3瘦素可增加内皮细胞单层的通透性:与正常对照组相比,瘦素刺激组Transwell下室FITC-dextran的荧光强度明显增加,差异有显著统计学意义。2.4瘦素可诱导HUVECs的细胞骨架重排:与正常对照组相比,瘦素刺激后内皮细胞F-actin重排,分布在细胞边缘的肌动蛋白纤维减少,横跨细胞体的应力纤维明显增多、变粗,且排列紊乱,同时伴有vinculin重组。2.5瘦素诱导内皮功能紊乱的分子机制2.5.1瘦素通过活化AKT/GSK3 β通路诱导内皮细胞功能紊乱:与正常对照组相比,瘦素刺激组内皮细胞AKT磷酸化水平增加,同时伴有p-GSK3β过表达,但AKT及GSK3β总蛋白的表达无明显变化。AKT基因敲低后,不仅p-GSK3β表达减低,而且明显减轻了瘦素诱导的内皮功能紊乱,包括减少了瘦素诱导的黏附分子表达、减弱了内皮细胞迁移及透通性,并改善了 F-actin细胞骨架紊乱。2.5.2瘦素通过诱导β-catenin核聚集参与内皮细胞功能紊乱:与正常对照组相比,瘦素刺激组β-catenin核蛋白表达明显增加。β-cateninshRNA病毒转染明显抑制了瘦素诱导的黏附分子合成及细胞骨架重构。此外,β-catenin病毒转染也明显减弱了瘦素诱导的内皮细胞迁移及透通性改变。我们进一步检测了 AKT shRNA质粒转染对β-catenin核转位的影响,western blot结果显示,AKT基因敲除明显减少了瘦素诱导的β-catenin核蛋白的表达。结论1.慢性肾脏病患者血清瘦素水平升高,且与内皮功能紊乱存在相关性。2.体外实验中,瘦素可诱导内皮细胞黏附分子合成增加、内皮细胞迁移性增强并增加内皮细胞单层通透性,从而引起内皮细胞功能紊乱。3.瘦素可能通过活化AKT/GSK3β及β-catenin信号通路导致F-actin细胞骨架重排,从而增加内皮细胞迁移和内皮细胞单层通透性,最终导致内皮细胞功能障碍。