论文部分内容阅读
海参是一种非常重要的水产经济动物,具有很高的营养和药用价值,海参的养殖及相关功能食品的开发日益受到关注。多种理化因素造成的海参自溶是新鲜海参保存、运输与加工过程中难以克服的主要问题。存在于海参体壁中的一系列内源性组织蛋白酶是海参自溶的主导因素,研究海参组织蛋白酶的酶学性质是调控和利用其自溶过程的重要前提。本文进行了海参体壁组织蛋白酶L的提取,纯化及酶学性质的研究。确定了海参体壁组织蛋白酶L的提取条件；采用阴离子交换层析、凝胶层析法对该酶进行了分离纯化；并利用SDS-PAGE电泳鉴定了该酶的分子量；研究了提纯酶的酶学性质。实验结果表明,海参体壁组织蛋白酶L的最佳提取条件为：含5mmol/L半胱氨酸、1mmol/L EDTA、0.2%Triton X-100的NaAc-HAc (50mmol/L, pH5.0)缓冲液；硫酸铵饱和度为80%。经DEAE Sepharose CL-6B.Sephadex G-75和TSK-GEL后,酶的纯度为最初的42.81倍,经SDS-PAGE测定分子量约为63kDa, Z-Phe-Arg-NMec为该酶的特异性底物,水解该底物Km和kcat砒值分别为69.92μM和12.80/S。提纯酶的最适反应pH和温度分别为5.0和50℃,不高于50℃下酶活力稳定。结果显示,Ca2+、Mg2+对该酶抑制不显著,Fe2+、K+、Mn2+对该酶有一定的抑制作用,Cu2+、Zn2+则能完全抑制该酶的活性。巯基抑制剂E-64和碘乙酸对酶完全抑制,相反巯基激活剂DTT和EDTA对酶有一定的激活作用,说明该酶为含巯基的蛋白酶。丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF、TI)和金属蛋白酶抑制剂(1,10-菲啰啉)对酶有部分抑制。作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的亮抑酶肽和抗痛素有效抑制了酶的活性,说明该酶属于半胱氨酸蛋白酶且含有巯基。上述结果充分证明分离纯化所得蛋白为组织蛋白酶L,且很可能以酶-抑制剂或者酶原形式存