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背景:研究发现淋巴细胞抗原6复合体K(LY6K)在多种类型癌症及肿瘤细胞系中存在过表达现象,而在相应的正常组织中却不表达或低表达,暗示其可能具有较高的诊断价值。目前在食管鳞癌中该蛋白自身抗体的表达情况尚未见报导。通过检测食管鳞癌中该基因的表达情况,可初步评估其诊断价值。目前该蛋白的抗体仍未商品化,因此利用原核表达系统对该蛋白进行表达,可为后续的抗体制备及检测工作打下基础。方法:利用半定量RT-PCR方法,对20例手术切除的食管鳞癌组织及20例癌旁组织样本进行LY6K mRNA表达水平的检测,并对实验结果进行统计学分析。根据LY6K cDNA序列设计引物,扩增开放阅读框架内495bp的DNA片段,并其定向插入到原核表达载体pET-28b中,获得了重组表达质粒。将经PCR、酶切鉴定及测序鉴定正确的重组质粒,转化入大肠杆菌E.coli Rosseta (DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测所表达的蛋白,对重组蛋白的诱导表达条件进行优化,并对重组蛋白进行可溶性分析。在变性条件下利用Ni-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白包被酶标板,利用间接ELISA的方法对62例食管鳞癌病人及58例正常对照血清中LY6K自身抗体进行检测,进而对其临床诊断价值进行评估。结果:LY6K mRNA在食管鳞癌组织中的平均表达水平显著高于癌旁组织(P<0.001)。经受试者特征(ROC)曲线分析,肿瘤组织样本中LY6K基因的高表达率75 % (15/20),而在癌旁组织中仅为10 %(2/20)。获得495 bp LY6K编码序列的DNA片段,将并将其插入原核表达载体pET-28b中,构建了LY6K重组蛋白的表达系统pET-28b-LY6K/Rosseta (DE3)。SDS-PAGE分析显示该重组表达菌可高效表达出18 kDa左右的融合蛋白,分子量大小与预期一致。通过改变IPTG的浓度,温度和诱导时间,最终确定了最佳诱导表达条件:IPTG终浓度0.4 mmo1/L,诱导时间8h,诱导温度28℃。目的蛋白以包涵体的形式存在。在变性条件下利用Ni-NTA亲和层析法纯化得到了高纯度的融合蛋白。通过间接ELISA法检测62例食管鳞癌病人和58例正常人血清中LY6K自身抗体后发现食管鳞癌病人组血清抗体水平明显高于正常人,P<0.001;ROC曲线分析表明,当选OD450值=0.598为cutoff值时,LY6K自身抗体用于诊断食管鳞癌的敏感性为80.6 %,特异性为78.7 %。结论:LY6K基因在食管鳞癌中表达水平显著高于癌旁组织,具有一定的诊断价值; LY6K重组蛋白可在大肠杆菌中获得高效表达,纯化后可用作免疫诊断抗原;食管鳞癌血清中存在LY6K自身抗体,且该抗体可被用于食管鳞癌的筛检和诊断。