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前言WNK4(with no lysine[K]kinase-4)基因是新近分离克隆的一个蛋白激酶基因,该基因第7外显子(exon7)和第17外显子(exon17)突变可导致常染色体显性遗传性疾病,假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ)。研究表明WNK4可以作用于肾脏远曲小管和集合管上的离子转运体(Na-Cl共转运体,NCCT)和离子通道(钾离子通道,ROMK),从而起到对血压和离子平衡的调控作用。目前大量的研究集中在探索WNK4基因的功能上,但WNK4基因的上游调控因子仍不清楚。乙酰化在多种基因的表达调控中发挥重要作用,两类作用相反的酶,组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)参与调节蛋白质乙酰化状态。曲古抑菌素A(TSA)能够特异性抑制HDAC活性从而引起组蛋白和一些转录相关因子的乙酰化。迄今为止尚无有关乙酰化对WNK4基因表达调控的研究。本研究以TSA作为乙酰化作用因素,探索乙酰化对人胚肾HEK293细胞中WNK4基因rnRNA和蛋白表达水平的影响,并鉴定WNK4启动子区的GATA-1反应元件及TSA对GATA-1蛋白乙酰化水平及DNA亲和力和WNK4启动子活性的影响,从而探索乙酰化调节WNK4基因表达的机制。材料与方法一、实验材料1、人胚肾HEK293细胞系2、胚胎(胎龄22周)肾脏组织标本3、Real-time PCR及Western印迹杂交相关试剂4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂5、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相关试剂二、实验方法1、Real-time RT-PCR检测TSA刺激前后WNK4 mRNA表达水平的变化。2、Western印迹杂交检测TSA对WNK4蛋白表达水平的影响。3、应用软件及萤光素酶报告基因系统分析WNK4启动子结构。4、RT-PCR实验检测GATA-1mRNA在HEK293细胞及胚胎肾脏组织中的表达。5、EMSA及ChIP鉴定WNK4启动子内GATA-1反应元件及TSA对GATA-1蛋白与该位点结合力的影响。6、免疫沉淀结合Western印迹杂交检测TSA对GATA-1蛋白乙酰化水平的影响。7、萤光素酶报告基因检测GATA-1反应元件在TSA对WNK4启动子活性影响中的作用。结果1、Real-time RT-PCR结果显示TSA以浓度依赖方式上调WNK4 mRNA表达水平。2、Western印迹杂交表明TSA诱导的乙酰化使HEK293细胞中WNK4蛋白水平显著增加。3、软件分析及萤光素酶报告基因检测在WNK4启动子内发现了一些潜在的受乙酰化调控的转录因子结合位点。4、RT-PCR的结果提示GATA-1 mRNA在HEK293细胞及胚胎肾脏组织中有明显的表达。5、EMSA及ChIP实验在分别在体外及体内条件下证明了WNK4启动子-426～-416区为GATA-1反应元件,并且TSA使GATA-1蛋白与该位点结合增强。6、免疫沉淀结合Western印迹杂交显示TSA可直接引起GATA-1蛋白的乙酰化。7、应用萤光素酶报告基因系统证明了GATA-1反应元件是WNK4启动子中一个强大的正调控元件,同时它在TSA诱导的WNK4启动子的转录激活中发挥重要作用。结论1、WNK4启动子-426～-416区为GATA-1反应元件。2、TSA引起的GATA-1乙酰化可增强其与WNK4基因启动子GATA-1反应元件的结合,从而上调WNK4启动子转录活性,这是乙酰化调节WNK4基因表达的一种机制。