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目的:研究Hippo信号通路下游效应因子YAP/TAZ对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭的影响,并初步阐明干扰YAP和干扰TAZ表达是否可能通过调控细胞自噬影响RA-FLS的迁移和侵袭。方法:1、选择生长状态良好的RA-FLS,经FITC标记的鼠抗人CD90抗体和PE标记的鼠抗人CD55抗体孵育后采用流式细胞仪进行鉴定。2、运用 Western Blot 检测 RA-FLS(RA-FLS 组)和正常人 FLS(NC-FLS 组)中 YAP和TAZ的表达情况,并分析两组的表达差异。3、构建干扰YAP和干扰TAZ表达的慢病毒载体,包装慢病毒后感染细胞,进一步使用嘌呤霉素筛选获得稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)、稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)以及空载病毒对照组(sh-C组)的细胞模型,并采用RT-qPCR与Western Blot进行验证。4、利用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的影响。5、通过Western Blot检测干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS中自噬相关蛋白LC3B和p62表达的影响。6、利用细胞免疫荧光染色实验研究干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS中LC3B斑点形成的影响。7、运用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察自噬抑制剂CQ、3-MA对干扰YAP和干扰TAZ表达后RA-FLS迁移和侵袭的影响。8、通过Western Blot检测自噬抑制剂CQ、3-MA对干扰YAP和干扰TAZ表达后RA-FLS中LC3B和p62表达的影响。结果:流式细胞仪鉴定MH7A表达CD90和CD55的阳性率为96.7±1.18%(n=3),明确该细胞株为RA-FLS,可用于后期实验。本课题首先采用Western Blot检测RA-FLS和NC-FLS中YAP和TAZ的表达,结果显示,RA-FLS中YAP和TAZ的表达明显升高,提示RA-FLS中YAP和TAZ呈现高表达。其次,构建干扰YAP和干扰TAZ表达的慢病毒载体,包装慢病毒后感染细胞,进一步使用嘌呤霉素筛选获得稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)、稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)以及空载病毒对照组(sh-C组)的细胞模型,并采用RT-q与Western Blot进行验证,结果显示,sh-YAP组RA-FLS中的YAP和sh-TAZ组RA-FLS中TAZ分别在mRNA、蛋白水平上表达明显降低。同时,利用RT-qPCR检测了目前公认的受到YAP/TAZ转录调控的下游靶基因CTGF和CYR61的mRNA水平,结果表明,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中CTGF和CYR61的mRNA表达水平也显著下降。结果提示,细胞模型构建成功,可用于进一步实验。为了研究稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-FLS迁移和侵袭的影响,运用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验进行观察,细胞划痕实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组划痕愈合明显减慢;Transwell细胞迁移实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS迁移的数目明显减少,与细胞划痕实验结果相符;Transwell细胞侵袭实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS侵袭的数目明显减少。结果提示,干扰YAP和干扰TAZ表达可抑制RA-FLS的迁移和侵袭。进一步研究了稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-FLS自噬的影响,Western Blot实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中LC3B-Ⅱ的表达量明显上升,而p62表达明显下降。细胞免疫荧光染色实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中LC3B斑点形成增加。结果表明,干扰YAP和干扰TAZ表达可促RA-FLS的自噬。为了阐明稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-迁移和侵袭的影响是否可能通过调控细胞自噬来实现的,进一步探究了自噬抑制剂CQ、3-MA对sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS的作用,细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和袭实验结果显示,与sh-YAP组相比,sh-YAP+CQ组、sh-YAP+3-MA组RA-FLS迁移和侵袭明显增强;与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+CQ组、sh-TAZ+3-MA组RA-FLS迁移和袭也明显增强。Western Blot结果显示,与sh-YAP组相比,sh-YAP+CQ组LC3B-Ⅱ、p62的表达明显升高;与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+CQ组LC3B-Ⅱ、p62的表达明显升高。与sh-YAP组相比,sh-YAP+3-MA组LC3B-Ⅱ表达量稍下降,但p62的表达明显升高。与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+3-MA组LC3B-Ⅱ表达也稍下降,但p62的表达也明显升高。果提示,抑制RA-FLS自噬可逆转干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的响。结论:RA-FLS中的YAP和TAZ呈现高表达,干扰YAP和干扰TAZ表达可明显抑制RA-的迁移和侵袭。同时,干扰YAP和干扰TAZ表达能够促进RA-FLS的自噬,抑制RA-FLS的自噬可逆转干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的影响。实验结果表明,干扰YAP和干扰TAZ表达可能通过调控细胞自噬抑制RA-FLS的迁移和侵袭。