论文部分内容阅读
本研究利用中空纤维膜技术,在5升标准搅拌型自动控制发酵罐中进行大肠杆菌AS.1.183的过滤培养,大肠杆菌细胞的最高浓度可达250g/L(湿重,含水70%),细胞内多核苷酸磷化酶(PNPase)的活性可以稳定在80u/g(湿重)左右,发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近10倍。 在PNPase提取纯化的过程,研究了研磨破碎、超声波破碎、高压破碎大肠杆菌细胞的方法,发现超声波破碎方法明显优于其它方法,细胞破碎条件同PNPase活性有关。研究探索了使用中空纤维膜替代透析袋除盐的方法,此法在PNPase纯化过程中,不仅大大缩短了除盐时间,而且减少了缓冲液的用量。使PNPase的生产成本降低了很多。 利用大肠杆菌PNPase和5′-二磷酸核苷酸底物,通过控制底物的浓度及其反应条件,合成出错位双链核糖核酸(poly I∶C12U)试验样品,样品中的胞苷酸(C)和尿苷酸(U)的比值接近12∶1。 为证明合成的poly I∶C12U中C和U的分布情况,将单链的poly C12U反转录为对应的单链DNA,经PCR扩增获得特殊序列的双链DNA片段,再将该DNA片段克隆到T载体中,测序分析后证明C在poly C链中是不连续的,U在poly C12U合成时可均匀插入到poly C中。使用碱和碱性磷酸酶降解poly I∶C12U,使其生成三种核苷,经反相-高效液相色谱(RP-HPLC)测定也证明poly I∶C12U中的碱基I∶C∶U组成比例接近13∶12∶1。该方法可分析核苷的组成,可用于监控产品的制备过程。 使用小鼠、大鼠、犬静脉和腹腔的给药方法,研究了poly I∶C12U的急性毒性,结果表明poly I∶C12U的毒性很低,急性毒性反应是一过性可逆性反应,没有对机体造成明显损害。通过高、中、低不同剂量的polyI∶C和polyI∶C12U药物的热原试验比较,polyI∶C12U药物的毒副作用明显低于polyI∶C,对