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牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应,其中β-乳球蛋白是公认的主要乳过敏原之一,大约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。另外,表位是引发食物过敏的物质基础,对食物过敏原表位的探索是食物过敏研究的重要组成部分。因此,开展牛乳p-乳球蛋白表位的研究具有重要意义。此外,本研究将p-乳球蛋白表位构建成表位串联体,优化组合的串联体将具有独立的抗原性,在基于食物过敏原表位检测的研发中具有潜在的应用价值。本论文工作研究内容包括牛乳p-乳球蛋白线性表位串联体的分子设计,表位串联体在原核系统中的表达及纯化,抗表位串联体多克隆抗体的制备及表位串联体的抗原性和过敏原性评估。研究的主要方法、结果及结论如下：1.以牛乳p-乳球蛋白与人血清IgE结合的7个B细胞线性表位(B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7)和1个T细胞表位(T)为研究对象,选择适当的间隔序列将其串联。理论上有5040种组合方式。通过DNAStar及SOMPA网络服务器筛选合适的组合方式,使构建的串联体中各表位具有独立的抗原性。B细胞表位之间的间隔序列为甘氨酸(G),T细胞与B细胞表位之间的间隔序列是两个赖氨酸(KK)。最后设计出的串联体分子组合结构为T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。2.在设计好的串联体分子两端分别加上酶切位点BamHI和EcoRI后进行基因合成,合成的基因克隆到载体pMD19-T中。经过双酶切、连接、转化等步骤,成功构建了表达载体pGEX-4T-1-串(pGEX-4T-1-tan),并转化到表达菌株E.coliBL21 (DE3)pLysS中。3.构建好的载体经IPTG诱导表达,表达出的蛋白为串联体融合蛋白,分子量约为39.5kD。经过SDS-PAGE和Western blotting鉴定,表达结果正确。同时通过对诱导温度、时间及IPTG浓度的优化,得到目的蛋白可溶性表达的最佳条件为：23℃诱导4h,IPTG浓度为0.3mmo1／L。表达的蛋白带有GST标签,纯化后其蛋白浓度为4mg／ml。4.以纯化的串联体融合蛋白为抗原,按常规的免疫程序对两只日本大白耳兔进行免疫,间接ELISA检测结果表明,纯化的串联体蛋白具有良好的抗原性,日本大白耳兔对其具有很好的免疫应答。得到的抗体效价分别1：128,000和1：64,000。通过间接ELISA及免疫印迹实验,结果表明本实验纯化的串联体蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应。5.用牛乳过敏患者血清检测串联体融合蛋白的过敏原性,结果显示串联体融合蛋白具有一定的过敏原性。