论文部分内容阅读
研究目的Apelin受体,也称血管紧张素受体AT1相关受体蛋白(Putative receptor protein related to AT1,APJ),是 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)A 类家族的成员之一,参与心血管和中枢神经系统的功能调节,是一类重要的药物靶点。我们前期研究发现APJ能够与GPCR家族的其他成员(如阿片受体和神经降压素I型受体等)发生异源二聚化反应,且具有与单体不同的功能特点,但是关于APJ同源二聚化/寡聚化反应及其动态过程、交界面和功能机制的研究仍然甚少。本课题利用全内反射荧光显微镜、MALDI-TOF质谱法、共振能量转移和实时细胞分析仪等技术研究APJ的同源二聚化/寡聚化反应及其在细胞中占有的比例、动态过程、交界面和功能等,探讨APJ参与的重要生理和病理过程中细胞内信号的转导机制,为临床开发新药物治疗靶点提供理论和实验依据。研究方法1.全内反射荧光显微镜对GFP和APJ-GFP的荧光成像利用全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope,TIRFM)(100× 1.47 NA 油镜)分别对绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)和中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞膜上的APJ-GFP进行荧光成像,成像参数为激光强度8%、曝光时间3幅/秒、隐失波的渗透深度～150 nm。Origin8.0软件对成像荧光颗粒进行高斯分布(Gaussian)分析。2.免疫共沉淀、共振能量转移和双分子荧光互补-生物发光共振能量转移检测APJ同源二聚化/寡聚化反应及其依赖G蛋白的信号通路利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、生物发光共振能量转移(Bioluminescence resonance energy transfer,BRET)和荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)在 CHO 细胞中检测 APJ 同源二聚体,并检测在拮抗剂([A1a13]apelin-13)或激动剂(apelin-12、13、15、17或36)处理下,APJ同源二聚体的变化。利用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)-BRET在CHO细胞中检测APJ同源寡聚体(homooligomers),并检测在拮抗剂([Alal3]apelin-13)或激动剂(apelin-12、13、15、17或36)处理下,APJ同源寡聚体的变化。用BiFC-BRET检测APJ同源二聚体依赖G蛋白的新型信号通路。3.邻近生物素化检测APJ同源二聚体的动态过程利用激光共聚焦扫描显微镜(Laser confocal scanning microscope,LCSM)(60×油镜)检测BirA-APJ和AP-APJ之间的生物素化反应(反映APJ同源二聚化的发生),流式细胞仪检测随着时间的推移生物素化程度的变化(反映APJ同源二聚体的动态过程),藻红蛋白用488 nm激发器激发,575/24 nm滤光器检测。4.基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪检测APJ同源二聚体的交界面利用APJ的跨膜肽(Transmembranedomain,TMD)和基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer,MALDI-TOF MS)检测APJ同源二聚体的交界面,并构建一系列APJ突变体(如 APJM36140A、APJL401.4A、APJV732.48A、APJT9 8 3 44A、APJV1484.44A、APJL2 1 8 5 55A 和 APJF3077.51A 等),利用 BRET1 和 TIRFM 检测和筛选 APJ 同源二聚体交界面上的相互作用位点。5.实时细胞分析仪监测人脐静脉内皮细胞的增殖利用实时细胞分析仪(Real-Time Cell Analyzer,RTCA)记录人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖过程,检测 apelin-13处理下APJ同源二聚体对HUVECs增殖的影响。研究结果1.GFP和APJ-GFP的荧光成像及定量利用TIRFM的488 nm激发光分别激发GFP和APJ-GFP,图像呈多个绿色荧光颗粒,GFP荧光颗粒高斯分布分析的结果显示出一个正态分布且平均荧光强度为308.08±3.38(mean±SD)(n=321)。在荧光颗粒密度小于0.3颗粒/平方微米(particle/μm2)的CHO细胞膜上,APJ-GFP荧光颗粒高斯分布分析的结果显示出三个正态分布,其平均荧光强度分别为311.7±12.37、610.48±5.85和896.87±21.86(mean±SD)(n=1087),结合GFP的荧光强度,提示APJ可以以三种状态存在——单体、同源二聚体和寡聚体,且分别占有比例为～40%、～36%和～24%,通过归一化荧光强度公式y=(x-xc)/w,可进一步确认图像中的单体、同源二聚体和寡聚体。2.APJ可以不依赖拮抗剂或激动剂的诱导形成同源二聚体/寡聚体将HA-APJ和Myc-APJ共转染CHO细胞,提取蛋白进行Co-IP,结果显示APJ能够形成同源二聚体。利用BRET1和FRET在CHO细胞中实时、动态地检测APJ同源二聚化反应,结果显示共转染组(APJ-EGFP+APJ-Rluc)与阴性组(mOX2aR-Rluc+mOX2aR-EGFP)相比,BRET ratio 明显升高(*P<0.05,n=4),共转染组(APJ-CFP+APJ-Venus)具有明显的FRET信号,且FRET效率为56%(**p<0.01,n=4),进一步表明APJ能形成同源二聚体。用拮抗剂([Ala13]apelin-13)或激动剂(apelin-12、13、15、17或36)处理CHO细胞,检测各组BRET ratio,结果显示实验组与未处理组相比,BRET ratio没有明显的差异变化,表明APJ可以不依赖拮抗剂或激动剂的诱导形成同源二聚体。利用BiFC-BRET在CHO细胞中研究APJ同源寡聚化反应,结果显示实验组(APJ-Rluc+APJ-VC155+APJ-VN173)与阴性组(mOX2αR-Rluc+mOX2αR-VC155+mOX2αR-VN173)相比,BRET ratio明显升高(**P<0.01,n=4),表明APJ能形成同源寡聚体。用拮抗剂([A1a13]apelin-13)或激动剂(apelin-12、13、15、17或36)处理CHO细胞,检测各组BRET ratio,结果显示实验组与未处理组相比,BRET ratio没有明显的差异变化,表明APJ可以不依赖拮抗剂或激动剂的诱导形成同源寡聚体。3.APJ同源二聚体与单体处于动态转换中邻近生物素化的结果显示BirA-APJ和AP-APJ之间能发生生物素化,且在15 min内生物素化程度逐渐升高(1.805%、13.3%和22.5%),表明APJ之间存在瞬时相互作用,能不断形成和解离新的受体复合物;利用TIRFM进一步实时观察CHO细胞中的APJ-GFP,发现APJ同源二聚体与单体在细胞膜上处于动态转换中,APJ单体与二聚体在900 ms之内就能够完成相互转换。4.APJ同源二聚体交界面为TMD1、TMD2、TMD3和TMD4将 pcDNA3.1(+)-APJ 转染 CHO 细胞,HIV TAT-TMD1-7(4 μM)孵育后进行常规的蛋白提取和MALDI-TOF MS检测,结果发现APJ同源二聚体的交界面主要为 TMD1、TMD2、TMD3 和 TMD4。利用 BRET1 检测显示 TMD1、TMD2、TMD3和TMD4均能明显降低APJ同源二聚体的BRET信号(55-75%)(**P<0.01,n=4),表明TMD能够阻断APJ同源二聚体的形成,对APJ同源二聚体的形成具有重要作用。5.APJ同源二聚体具有新的信号转导通路并能促进HUVECs的增殖Gα-Rluc8、APJ-VN173 和 APJ-VC155 共转染 CHO 细胞,在 apelin-13 处理下进行BRET1检测,结果发现与对照组(APJ单体能激活Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαq和Gαo信号转导通路)相比,APJ同源二聚体只能激活Gαi3和Gαq信号转导通路(*P<0.01,n=4)。用 RTCA 在 HUVECs 里检测 apelin-13 处理下 APJ 同源二聚体引起的细胞反应,结果显示二聚体组(apelin-13)与单体组(TMD1 +apelin-13)相比,细胞指数(Cell index,CI)较高,表明APJ同源二聚体能够促进HUVECs的增殖。研究结论(1)APJ能形成同源二聚体和寡聚体,在受体密度小于0.3 particle/pm2的情况下,APJ单体、同源二聚体和寡聚体分别占有～40%、～36%和～24%,且在CHO细胞膜上处于动态转换中,能够不断地结合和解离。(2)APJ同源二聚体的交界面为TMD1、TMD2、TMD3和TMD4。(3)APJ同源二聚体具有新的功能特征,APJ同源二聚体在细胞内通过不同于单体的信号传导途径,激活Gαi3和Gαq,显著促进HUVECs的增殖。该研究阐明了 APJ的同源二聚化和寡聚化、单体和二聚体的分布情况、动态过程、交界面以及功能,对APJ二聚体和寡聚体的化学性质和细胞内信号转导途径的研究具有重要理论意义,为寻找有效的治疗靶点,开发新的药物提供详实的实验资料,具有重要应用价值。