论文部分内容阅读
目的:研究水通道蛋白9(Aquaporin9,AQP9)过表达对肝癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制研究。方法:(第一部分)实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测正常肝细胞株L02和肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B及Huh-7中AQP9表达水平,并筛选出SMMC-7721作为后续实验肝癌细胞株。将重组慢病毒LV-AQP9-GFP(以空载体LV-GFP作为阴性对照)导入SMMC-7721细胞中,构建AQP9过表达SMMC-7721/LV-AQP9重组细胞模型。激光共聚焦显微镜下观察重组慢病毒LV-AQP9-GFP在SMMC-7721细胞中的转染效率,蛋白质印迹法检测AQP9在SMMC-7721/LV-AQP9重组细胞模型中过表达水平。细胞肿胀实验检测AQP9过表达细胞模型中AQP9作为水通道功能活化程度。采用划痕实验、Transwell侵袭实验检验AQP9过表达对SMMC-7721细胞迁移、侵袭的影响。(第二部分)在动物水平,将AQP9过表达重组肝癌SMMC-7721/LV-AQP9细胞和SMMC-7721/LV-GFP细胞接种于裸鼠皮下构建裸鼠皮下移植瘤模型,动态观察2组裸鼠皮下移植瘤生长的差异。同时,通过尾静脉注射重组肝癌smmc-7721/lv-aqp9细胞和smmc-7721/lv-gfp细胞构建肝癌肺转移模型,观察2组裸鼠肺表面癌结节转移数量,并采用he染色观察肺组织中转移瘤的情况。(第三部分)蛋白免疫印迹法检测aqp9过表达重组肝癌smmc-7721/lv-aqp9细胞和smmc-7721/lv-gfp细胞中emt相关蛋白(e-cadherin、n-cadherin、vimentin),pi3k/akt信号通路相关蛋白pi3k、akt、p-akt及基质金属蛋白酶mmp2、mmp9的表达差异。采用免疫组化法检测移植瘤组织中e-cadherin、n-cadherin、vimentin蛋白表达。结果:(第一部分)肝癌细胞株hep3b不表达aqp9,而smmc-7721、hepg2、huh-7中aqp9mrna和aqp9蛋白表达均较正常肝细胞株l02显著降低(p值均<0.05),其中smmc-7721中aqp9mrna和aqp9蛋白表达量最低。激光共聚焦显微镜下观察发现,重组慢病毒lv-aqp9在smmc-7721细胞中的转染效率为90%左右,并通过gfp荧光信号定位发现,aqp9-gfp融合蛋白绿色荧光主要分布在smmc-7721/lv-aqp9细胞的细胞膜上。在smmc-7721/lv-aqp9重组细胞模型(aqp9组)中aqp9蛋白表达量较空载对照组smmc-7721/lv-gfp细胞(gfp组)显著增加(p<0.01)。在低渗状态下smmc-7721/lv-aqp9重组细胞(aqp9组)膨胀体积较smmc-7721/lv-gfp细胞(gfp组)显著增大(p<0.05),而用hgcl2(aqp9阻滞剂)阻滞水通道蛋白活性后,在低渗状态下smmc-7721/lv-aqp9重组细胞(aqp9组)和smmc-7721/lv-gfp细胞(gfp组)膨胀体积无显著差异(p=0.783)。划痕实验显示,aqp9组细胞48h的迁移率(6.38%±1.70%)较gfp组(16.74%±1.40%)下降(p<0.01)。transwell实验结果显示,aqp9组48h穿过小室细胞数(57±8)较gfp组(95±11)减少(p<0.01)。(第二部分)动物水平,在裸鼠皮下移植瘤模型中,重复测量方差分析2组移植瘤体积提示,aqp9组移植瘤体积显著小于gfp组(f分组=79.161,p分组=0.000),aqp9组皮下移植瘤生长速度明显小于gfp组(f分组×时间=18.481,p分组×时间=0.002)。在裸鼠肺转移模型中,he染色观察aqp9组裸鼠肺组织中转移瘤体较gfp组更小,aqp9组裸鼠肺表面癌结节转移数量较gfp组显著减少(p<0.05)。(第三部分)westernblot检测结果显示aqp9过表达后上皮表型标志物(e-cadherin)、pi3k、p-akt蛋白表达上调(p值均<0.05),间皮表型标志物(n-cadherin)表达下调(p<0.05),而vimentin、akt、mmp9、mmp2蛋白表达水平较gfp组均无明显变化(p值均>0.05)。同样,免疫组化及光密度分析结果显示,aqp9组移植瘤中e-cadherin蛋白表达水平较gfp组上调(p<0.05),aqp9组移植瘤中n-cadherin、vimentin蛋白表达水平较gfp组下调(p<0.01)。结论:肝癌细胞中aqp9表达水平较正常肝细胞下调。aqp9过表达抑制肝癌smmc-7721细胞侵袭转移及上皮间质转化,而pi3k/akt信号通路可能参与这一调控过程。此外,aqp9过表达对基质金属蛋白酶MMP9和MMP2表达无影响。