乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的持续感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生的最主要因素。HBV X (HBx)基因在肝细胞基因组中的整合和X蛋白的反式激活作用对HCC的发生和发展具有重要意义,但其致癌的分子机制目前尚不十分清楚。对HBx的研究大多着眼于X蛋白的反式激活功能,而忽略了HBx基因在肝细胞基因组整合的作用。研究表明,在HBV导致肝癌发生过程中,病毒DNA在宿主基因组中有高频率的整合,整合部位随机分布于多条染色体上,这种整合多发生在HBV X基因区域。前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系(L-02-X)发生恶性转化,推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。此外,HBx蛋白对HCC的发生和转移具有重要作用。近年来研究发现,骨桥蛋白(osteopontin, OPN)及钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit 1,Capn4)与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移。为了进一步阐明HBx基因/蛋白与肝癌发生发展的关系,本研究应用细胞模型和病人肝癌组织标本,探讨了HBx基因整合在肝癌发生中的直接作用和HBx蛋白促进肝癌细胞迁移作用的分子机制,主要研究内容如下：第一部分：HBx基因整合与肝癌发生关系的研究一、HBx基因突变体稳定整合细胞模型的建立前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系(L-02-X)发生了恶性转化,因此推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。但是,其中包含了HBx蛋白的反式激活作用。为了探讨HBx基因整合与肝细胞转化的直接关系,首先建立了无反式激活功能的HBx基因突变体稳定整合的细胞模型。本研究中,HBx基因被随机分成五个片段,并分别克隆到真核表达载体pCMVTag-2B,获得的质粒分别命名为pCMV-X1、pCMV-X2、pCMV-X3、pCMV-X4和CMV-X5。将此五个质粒及克隆有全长HBx基因的质粒分别瞬时转染人肝细胞L-02使其蛋白过表达,同时检测对核因子-κB(NF-κB)和人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子活性的影响,发现与野生型相比,五个突变的HBx基因片段失去了对NF-κB和hTERT启动子活性的上调作用。通过基因转染技术将克隆有这五个片段的质粒分别导入人正常肝细胞系L-O2和人肝癌细胞系H7402中,经G418筛选,获得了稳定转染细胞系,分别命名为L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5(或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5)。二、HBx基因片段整合导致肝细胞恶性转化的作用为了阐明L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5细胞系的恶性表型,进行了免疫印迹实验。结果显示,与对照组相比,在L-02-X3和L-02-X5细胞中有甲胎蛋白(AFP)表达,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则检测不到AFP。软琼脂克隆形成实验显示,与对照组相比,L-02-X3和L-02-X5细胞克隆形成能力显著增强,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞克隆形成能力与对照组相比无明显差异。进一步研究发现,将L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5分别皮下接种裸鼠后,L-02-X3和L-02-X5细胞接种的裸鼠在接种部位形成原位瘤,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞接种的裸鼠则未能成瘤。本结果说明,整合有HBx基因片段的L-02-X3和L-02-X5细胞发生了恶性转化,HBx基因整合与肝细胞的转化直接相关。三、HBx基因整合导致肝细胞转化分子机制的研究1、HBx基因整合模式的鉴定。提取L-02-X细胞基因组DNA,应用HBx-AluPCR方法检测HBx基因整合模式,测序结果显示,HBx基因整合到Alu核心序列和亚端粒DNA(subtelomeric DNA)序列上游,整合后HBx基因发生了3’末端(381-465 bp)缺失,产生HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。然后,设计针对该重组体中HBx基因和亚端粒的引物进行PCR,在其他HBx基因稳定整合的细胞系(如H7402-X、3T3-X、HepG2-X和HepG2.2.15)中检测上述重组体是否存在。结果显示,仅在H7402-X细胞系中检测到该重组体。2、HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体与肝细胞转化的关系。为了阐明该重组体是否参与肝细胞的转化,应用上述特异于HBx基因和亚端粒的引物,在稳定整合HBx基因突变体的细胞系(L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5；H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5)中进行验证。结果显示,在上述发现的已发生恶性转化的L-02-X3和L-02-X5(或H7402-X3和H7402-X5)细胞中检测到HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而未发生转化的细胞无该重组体。为了进一步提供HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致肝细胞发生转化的证据,应用报告基因及免疫印迹的方法对L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4、L-02-X5和L-02-X(或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4、H7402-X5和H7402-X)细胞系转录因子启动子活性及癌蛋白表达进行检测,结果显示NF-κB、AP-1和hTERT启动子活性在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、(或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X)细胞中显著增强,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则与对照组无明显差异。c-Myc、PCNA和Bcl-2蛋白表达在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、(或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X)细胞中显著上调,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞中则与对照组无明显差异。提示,HBx基因整合导致的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组是肝细胞转化的重要原因之一。3、在肝癌和癌旁组织中检测HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。应用PCR方法对60例肝癌组织和癌旁组织中HBx基因进行检测,发现HBx在60例肝癌组织及其癌旁组织中有44例(73.3%)。然后,应用PCR方法在44例HBx阳性的肝癌组织及其癌旁组织中检测上述重组体,结果发现其中有5例肝癌组织中存在与细胞模型中相同的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而在其对应的癌旁组织无上述重组体,临床标本检测结果进一步证实HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组与肝癌发生有密切的关系。本研究发现HBx基因整合与肝细胞转化具有直接的关系,HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致基因组不稳定是肝细胞转化的重要原因之一。这一发现首次为揭示HBV DNA在肝细胞基因组中整合的致癌作用提供了直接证据,对于肝癌的预防具有重要的指导作用。第二部分：HBx蛋白促进肝癌细胞迁移分子机制的研究近年研究发现OPN和Capn4与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移,为此进行了以下研究：一、HBx蛋白促进肝癌细胞迁移信号传导途径的研究本研究对HBx蛋白促进肝癌细胞迁移的信号传导途径进行了探讨。前期研究发现HBx蛋白通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；在此基础上,进一步研究显示HBx蛋白在启动子转录活性、mRNA及蛋白等水平通过5-脂氧化酶(5-LOX)上调肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达；进而,OPN可以通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；而Capn4则以正反馈的形式对肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达起调节作用。体外划痕实验显示,HBx蛋白可显著增强肝癌细胞HepG2的迁移能力,而对HepG2-X细胞中OPN或Capn4进行RNA干扰后,其迁移能力受到明显抑制。表明,HBx蛋白通过正反馈环HBx/5-LOX/OPN/NF-κB/Capn4/OPN促进肝癌细胞迁移。二、HBx蛋白突变体HBxΔ127促进肝癌细胞迁移分子机制的研究实验室前期研究发现了一个新的HBx蛋白突变体,将其命名为HBx△127。研究表明,HBx△127具有明显促进肝癌细胞增殖的作用。在此基础上,本研究探讨了HBx△127对肝癌细胞迁移的影响,结果发现HBx△127具有促进肝癌细胞迁移的作用。HBx△127可通过5-LOX上调肝癌细胞中OPN的表达,进而促进肝癌细胞迁移。与野生型HBx蛋白相比,HBx△127促进肝癌细胞迁移的作用更强。上述实验结果进一步丰富了HBx蛋白及其突变体促进肝癌细胞迁移的分子机制,为肝癌的治疗提供了理论基础。