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【研究背景与目的】肺癌是全球范围内最为常见的癌症之一,其中非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)占大部分(85%)。遗传因素是肿瘤发生的重要原因。转化生长因子-beta信号通路(TGF-βsignaling pathway)能够调节从胚胎发育到组织内环境的稳态等一系列的生物功能。而TGF-β信号通路的紊乱对于非小细胞肺癌的发生和发展都起到关键的作用。该通路中各组分在癌症发生发展中的异常表达是导致TGF-β信号通路紊乱的主要原因,其中膜受体TGFβR1和转录因子SMAD4是TGF-β信号级联传递的关键蛋白。研究发现他们在非小细胞肺癌中频繁下调表达。由于二者在NSCLC中突变频率很低,所以表观机制可能是其异常表达的潜在原因之一。mi RNA在转录后水平对基因的表达起调控作用,人类中大部分基因的表达受到mi RNA的靶向直接调控。预测分析显示TGFβR1和SMAD4也可以受到mi RNA的调控,本研究旨在探讨NSCLC中TGFβR1和SMAD4异常表达的mi RNA调控机制,阐明mi RNA在NSCLC发生发展中的重要作用,为NSCLC的早期诊断和治疗提供新的思路和实验依据。【研究方法】1)实时定量荧光PCR检测m RNA和mi RNAs的表达,western blot检测蛋白的表达情况;2)双荧光报告载体技术检测mi RNA与转录本3’UTR预测位点的靶向作用关系;3)利用慢病毒载体构建技术方法培养和筛选mi R-142-3p稳定过表达和沉默细胞株;4)利用细胞计数或CCK-8细胞增殖检测技术来检测细胞的增殖能力变化;5)利用Transwell细胞迁移侵袭实验来检测细胞侵袭能力的变化;6)运用Mass ARRAY®飞行质谱技术定量检测分析mi R-205启动子区DNA甲基化情况。【研究内容】第一部分mi R-142-3p靶向抑制TGFβR1从而阻断TGF-β诱导的非小细胞肺癌生长抑制作用对NSCLC细胞株和组织中mi R-142-3p和TGFβR1基因的表达情况进行q RT-PCR或western blot检测分析发现,相对于正常支气管上皮细胞HBE,在NSCLC细胞株中TGFβR1 m RNA和蛋白下调表达,而mi R-142-3p上调表达;相对于癌旁组织,在NSCLC组织中TGFβR1 m RNA显著下调表达,mi R-142-3p上调表达,并且TGFβR1 m RNA与mi R-142-3p表达显著负相关。GEO芯片数据结果与本实验结果相似,表明TGFβR1与mi R-142-3p在NSCLC中差异表达是一个普遍现象,并且mi R-142-3p可能是导致TGFβR1表达下调的原因之一。通过Target Scan对TGFβR1进行预测分析,表明mi R-142-3p可能靶向作用TGFβR1 3’UTR特异序列。通过mi RNA mimics瞬时转染NSCLC细胞发现,mi R-142-3p可以显著下调TGFβR1 m RNA和蛋白表达,且其抑制物Anti-mi R-142-3p可以显著上调TGFβR1 m RNA和蛋白的表达。进一步的双荧光报告载体活性实验证实TGFβR1是mi R-142-3p直接调控的靶基因。我构建并筛选了mi R-142-3p稳定上调表达和稳定沉默的A549细胞株。进一步观察mi R-142-3p对TGF-β通路及其生物学功能的影响。实验结果表明,mi R-142-3p显著抑制了TGF-β通路活性,表现在通路中关键转录因子p-SMAD3的活性的下降。不仅如此,mi R-142-3p还阻断了TGF-β通路所诱导的细胞生长抑制作用,表现在调控细胞周期关键转录因子p21的下调表达。另一方面,mi R-142-3p抑制了TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT和侵袭能力。第二部分mi R-205靶向抑制SMAD4表达促进非小细胞肺癌的增殖对NSCLC组织中mi R-205和SMAD4的表达情况进行q RT-PCR检测分析发现,相对于癌旁组织,在NSCLC组织中SMAD4 m RNA显著下调表达,mi R-205显著上调表达,并且SMAD4 m RNA与mi R-205表达显著负相关。GEO芯片数据结果与本实验结果相似,表明SMAD4与mi R-205在NSCLC中差异表达较为频繁,并且mi R-205可能是导致SMAD4表达下调的原因之一。通过Target Scan对SMAD4进行预测分析,表明mi R-205可能靶向作用SMAD43’UTR特定序列。通过mi RNA mimics瞬时转染NSCLC细胞发现,mi R-205可以显著下调SMAD4 m RNA和蛋白表达,利用双荧光报告载体活性检测证实了SMAD4是mi R-205直接调控的靶基因。细胞增殖实验表明,mi R-205可以显著增强NSCLC细胞株的增殖能力,并且瞬时沉默SMAD4也可以达到相同的作用,表明mi R-205可以通过抑制SMAD4的表达来促进NSCLC细胞的增殖能力。针对mi R-205启动子区甲基化情况的检测分析发现,其-77Cp G位点的甲基化频率在NSCLC组织中显著低于癌旁组织,表明这可能是导致mi R-205在NSCLC中上调表达的原因之一。