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目的:B细胞通过分泌抗体和作为抗原递呈细胞参与免疫应答,新近发现,B细胞中存在的一种新的细胞亚群,即调节性B细胞,其通过分泌IL-10、IL-35和TGF-β等抑制性细胞因子发挥免疫负向调控效应,在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中发挥重要作用。Fcγ受体是免疫球蛋白(IgG)恒定区Fc段受体,属于免疫球蛋白超家族,主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。活化性FcγR种类很多,而抑制性FcγR人和小鼠均只有一种,即FcγⅡRb,广泛表达于B细胞和髓系细胞。多种免疫细胞功能均受其调控:抑制由BCR引起的钙流、细胞增殖和抗体分泌。我们在前期实验中发现,肺癌3LL小鼠及黑色素瘤B16F10小鼠体内存在一群高分泌IL-10的表型为CD19hiFcγRⅡbhi的新型调节性B细胞,这群B细胞能通过其高分泌的IL-10抑制活化CD4+T细胞的增殖。此外,我们发现,人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中存在表型为CD19+FcγRⅡbhi的B细胞亚群,且肺恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞的比例较正常对照组增高,但皮肤恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞的比例与正常对照组无明显差异。本研究在上述实验的基础上,探讨人外周血中存在的这群CD19+FcγRⅡbhiB细胞能否高分泌IL-10,是否具有免疫负向调控作用。
方法:1.收集2018年9月至2019年12月苏北人民医院确诊皮肤恶性肿瘤的患者外周血标本共11例,其中男5例,女6例,年龄32-76岁,中位年龄54岁;皮肤鳞癌7例,皮肤基底细胞癌2例,Bowns病1例,恶性黑色素瘤1例。收集苏北人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本共15例,其中男9例,女6例;年龄56-82岁,中位年龄69岁;肺腺癌8例,肺鳞癌5例,肺小细胞癌2例;收集正常体检者外周血标本11例,其中男6例,女5例,年龄22-42岁,中位年龄32岁。通过流式细胞仪分选正常人及皮肤、肺恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+B细胞,体外培养24小时后,ELISA法检测培养上清中白细胞介素10(IL-10)分泌水平。2.收集2019年3月至2019年10月苏北人民医院确诊皮肤恶性肿瘤的患者外周血标本共10例,其中男4例,女6例,年龄36-78岁,中位年龄57岁,皮肤鳞癌6例,基底细胞癌3例,Bowns病1例;收集苏北人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本共28例,其中男22例,女6例;年龄43-82岁,中位年龄62.5岁;肺腺癌13例,肺鳞癌10例,肺小细胞癌5例;收集正常体检者外周血标本13例,其中男8例,女5例,年龄18-38岁,中位年龄28岁。通过流式细胞术胞内染色法检测正常人及皮肤、肺恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+FcγRⅡbhi和CD19+FcγRⅡblowB细胞表达IL-10的情况。3.收集2019年10月到2020年1月扬州大学附属人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本10例,其中男6例,女4例,年龄42-76岁,中位年龄59岁;肺腺癌6例,肺鳞癌3例,肺小细胞癌1例。利用流式细胞术分选肺恶性肿瘤患者外周血PBMC的CD19+FcγRⅡbhiB细胞、CD19+FcγRⅡblowB细胞和CD4+T细胞,用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞,然后将活化T细胞分别与CD19+FcγRⅡbhiB细胞、CD19+FcγRⅡblowB细胞共培养7天后,流式细胞术检测CD4+T细胞中CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的比例,以分析肺恶性肿瘤患者外周血PBMC的CD19+FcγRⅡbhiB细胞对自体调节性T细胞的诱导情况。
结果:1.皮肤恶性肿瘤患者PBMC中CD19+B细胞上清分泌IL-10较正常对照组高,且存在显著性差异;肺恶性肿瘤患者外PBMC中CD19+B细胞上清分泌IL-10较正常对照组高,且存在显著性差异。2.正常人、皮肤恶性肿瘤、肺恶性肿瘤患者PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞表达IL-10的水平均高于CD19+FcγRⅡblowB细胞。3.肺恶性肿瘤患者PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞与自体T细胞共培养后诱导产生的Treg比例较单独自体T细胞高,且CD19+FcγRⅡbhiB细胞与自体T细胞共培养后诱导产生的Treg比例较CD19+FcγRⅡblowB细胞与自体T细胞共培养后高。
结论:人PBMC中存在的CD19+FcγRⅡbhiB细胞可以高分泌IL-10;肺恶性肿瘤患者PBMC中的CD19+FcγRⅡbhiB细胞可诱导自体Treg的产生,且与CD19+FcγRⅡblowB细胞相比,CD19+FcγRⅡbhiB细胞诱导自体Treg细胞产生的能力更强。
方法:1.收集2018年9月至2019年12月苏北人民医院确诊皮肤恶性肿瘤的患者外周血标本共11例,其中男5例,女6例,年龄32-76岁,中位年龄54岁;皮肤鳞癌7例,皮肤基底细胞癌2例,Bowns病1例,恶性黑色素瘤1例。收集苏北人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本共15例,其中男9例,女6例;年龄56-82岁,中位年龄69岁;肺腺癌8例,肺鳞癌5例,肺小细胞癌2例;收集正常体检者外周血标本11例,其中男6例,女5例,年龄22-42岁,中位年龄32岁。通过流式细胞仪分选正常人及皮肤、肺恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+B细胞,体外培养24小时后,ELISA法检测培养上清中白细胞介素10(IL-10)分泌水平。2.收集2019年3月至2019年10月苏北人民医院确诊皮肤恶性肿瘤的患者外周血标本共10例,其中男4例,女6例,年龄36-78岁,中位年龄57岁,皮肤鳞癌6例,基底细胞癌3例,Bowns病1例;收集苏北人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本共28例,其中男22例,女6例;年龄43-82岁,中位年龄62.5岁;肺腺癌13例,肺鳞癌10例,肺小细胞癌5例;收集正常体检者外周血标本13例,其中男8例,女5例,年龄18-38岁,中位年龄28岁。通过流式细胞术胞内染色法检测正常人及皮肤、肺恶性肿瘤患者外周血PBMC中CD19+FcγRⅡbhi和CD19+FcγRⅡblowB细胞表达IL-10的情况。3.收集2019年10月到2020年1月扬州大学附属人民医院确诊肺恶性肿瘤的患者外周血标本10例,其中男6例,女4例,年龄42-76岁,中位年龄59岁;肺腺癌6例,肺鳞癌3例,肺小细胞癌1例。利用流式细胞术分选肺恶性肿瘤患者外周血PBMC的CD19+FcγRⅡbhiB细胞、CD19+FcγRⅡblowB细胞和CD4+T细胞,用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞,然后将活化T细胞分别与CD19+FcγRⅡbhiB细胞、CD19+FcγRⅡblowB细胞共培养7天后,流式细胞术检测CD4+T细胞中CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的比例,以分析肺恶性肿瘤患者外周血PBMC的CD19+FcγRⅡbhiB细胞对自体调节性T细胞的诱导情况。
结果:1.皮肤恶性肿瘤患者PBMC中CD19+B细胞上清分泌IL-10较正常对照组高,且存在显著性差异;肺恶性肿瘤患者外PBMC中CD19+B细胞上清分泌IL-10较正常对照组高,且存在显著性差异。2.正常人、皮肤恶性肿瘤、肺恶性肿瘤患者PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞表达IL-10的水平均高于CD19+FcγRⅡblowB细胞。3.肺恶性肿瘤患者PBMC中CD19+FcγRⅡbhiB细胞与自体T细胞共培养后诱导产生的Treg比例较单独自体T细胞高,且CD19+FcγRⅡbhiB细胞与自体T细胞共培养后诱导产生的Treg比例较CD19+FcγRⅡblowB细胞与自体T细胞共培养后高。
结论:人PBMC中存在的CD19+FcγRⅡbhiB细胞可以高分泌IL-10;肺恶性肿瘤患者PBMC中的CD19+FcγRⅡbhiB细胞可诱导自体Treg的产生,且与CD19+FcγRⅡblowB细胞相比,CD19+FcγRⅡbhiB细胞诱导自体Treg细胞产生的能力更强。