骨质缺损仍是目前导致患者功能丧失及生活质量降低的重要问题。临床上最为常用的修复方法仍是自体骨移植，然而这种方法却存在着一定的弊端。寻求更为合适的骨缺损修复方法成为当今的研究热点，这就需要多学科的共同努力。组织工程的兴起为骨缺损的修复提供了一条广阔的途径。上世纪80年代发现了具有多项分化潜能的间充质干细胞，使其成为理想的骨组织工程种子细胞,同时支架材料的研究也逐渐从二维结构向三维结构转变。本实验提出了具有三维结构特性的钛网(Titanium web,TW)，拟通过体外成功培养兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)，观察钛网对兔骨髓MSCs的成骨作用。以便了解该材料作为骨组织工程支架材料的特性。材料和方法1.本实验所采用的三维钛网是由日本Kuboki教授设计、HI-LEX公司提供的。材料特性为20-100μm直径的钛纤维束编织而成，内部形状为类蜂巢状结构，孔的平均直径为50-250μm，孔隙率达60-87%（图1）。选取普通级新西兰大白兔，4～6周龄。采用20%乌拉坦按以5ml/kg体重的剂量麻醉新西兰大白兔，无菌条件下取出大白兔的股骨，并移入超净工作台。沿股骨干中间剪开，将髓腔内容物反复冲出。采用密度梯度离心与全骨髓贴壁培养相结合的方法将兔骨髓间充质干细胞从骨髓(Bone marrow,BM)中分离出来。2.兔骨髓MSCs的鉴定:倒置显微镜下观察细胞的生长特点，选取生长特性稳定的第三代细胞，待其达80%融合时，分别换用成骨诱导培养基及成脂肪诱导培养基。2周后通过碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP)染色、茜素红染色及油红O染色鉴定细胞是否已发生定向分化。判断体外培养的细胞是否为兔骨髓MSCs。3.将已成功获得的兔骨髓MSCs与细丝钛网共同培养，倒置显微镜下观察细胞能否顺利生长在钛网上。4.由于钛网的不透光性，倒置显微镜并不能准确观察细胞在钛网上的生长特点，故采用扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）来观察其生长特点。5.钛网与兔骨髓MSCs共同培养后，取出钛网，采用ALP染色观察分析钛网周围与其有接触的兔骨髓MSCs的成骨特性。结果1.原代兔骨髓MSCs培养早期可见少数单个核细胞贴壁，形态细胞呈多角形。6-10d后细胞增殖速度加快并且发生细胞间的融合，细胞形态表现为成纤维细胞样的长梭形，且细胞形态逐渐均一，融合后表现为鱼肉状。2.对原代培养的兔骨髓MSCs进行成骨及成脂诱导，对于成骨诱导组2周后行茜素红染色及ALP染色，可见胞浆中有矿化结节及较多的棕红色颗粒。对于成脂诱导组，显微镜下观察细胞体积变大,核周可见空泡样结构。进行油红O染色,可见细胞内有红色脂滴,有的融合成大脂滴,有的成串珠样排列。3.将钛网与兔骨髓MSCs共同培养后在倒置显微镜下观察细胞及钛网的关系时，由于钛网的不透光性，偶可见钛网支架边上有细胞生长。通过SEM，可以观察到兔骨髓MSCs能良好的生长在钛网上，细胞与材料复合培养1周后，细胞已在材料表面和孔隙内均可黏附和生长，但数量较少；随着时间的延长，细胞进一步生长、分化和增殖。2周后大量细胞粘附在钛网上，细胞数量明显多于1周时，细胞形态呈长梭形，细胞间相互交错生长，呈网状覆盖材料的表面，同时可见细胞分泌的基质也沉积于细胞周围及支架表面。4.钛网与兔骨髓间充质干细胞共同培养2周后，取出钛网，将位于孔板底部的细胞进行ALP染色，见与钛网接触想细胞胞浆内出现较多的棕红色颗粒，并且颗粒聚集呈线形。而对照组呈弱阳性，仅有少量棕红色颗粒，且颗粒呈散在分布。结论1.通过密度梯度离心与全骨髓贴壁培养相结合的方法能成功体外分离及培养兔骨髓MSCs。2.具有三维结构的人工细胞外支架50μm细丝钛网对兔骨髓MSCs无毒性，细胞能良好的生长在支架上，且钛网支架能促进兔骨髓MSCs向成骨细胞方向分化，为其成为理想骨组织工程修复材料提供一定的实验基础及支持。