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3-氯-1,2-丙二醇(3-chloro-1,2-propanediol,3-MCPD)是食品加工过程中产生的一种污染物,高温时,3-MCPD常作为甘油酯、磷脂、甘油和盐酸的反应产物。因此,热加工过程中的高盐食品(如汤类、酱料类)、高脂食品(如肉制品、奶制品)特别容易产生此种化合物。3-MCPD易溶于水和油脂,一经吸收可随血液循环系统分布到各个脏器,主要危及肾脏和雄性生殖系统。薯蓣皂苷元(diosgenin,DIO)是一种天然存在的植物次生代谢产物,在山药、黄姜、穿龙薯蓣中含量较高。近些年随着对DIO研究的深入,发现其具有肿瘤抑制、消炎、抗氧化、糖尿病肾病保护等多种生理活性。但至目前,国内外未有文献报道过DIO对3-MCPD引起的肾损伤的保护作用。本文主要在细胞水平上研究DIO对3-MCPD诱导的肾细胞损伤的干预作用,并从线粒体功能尤其是线粒体分裂融合动力学平衡、线粒体介导的凋亡,内质网应激反应角度深入探讨DIO对3-MCPD引起的肾细胞毒性的保护作用及机制。本研究将为解释薯蓣皂苷元在3-MCPD肾毒性过程中的保护作用提供有力的科学基础,也为薯蓣类植物的生产及薯蓣类食品的开发提供理论依据。本文的主要研究内容和结果分为以下三部分:(1)DIO对3-MCPD诱导的肾细胞损伤具有明显的缓解效应。2、6、8μM DIO单独预处理3 h再与10 m M 3-MCPD协同作用24 h时细胞存活率从70%显著上升至90%、96%、94%。同时,DIO显著抑制了3-MCPD诱导的LDH释放率,保护了细胞膜结构完整性。凋亡检测表明,DIO能够显著减少3-MCPD引起的染色质固缩,2、6、8μM DIO协同处理使细胞凋亡率从26.56%降低到了5.93%、1.75%、2.53%。薯蓣皂苷元能够显著降低3-MCPD导致的凋亡执行蛋白Caspase 3/7的酶活性水平。可见,薯蓣皂苷元能够通过抑制凋亡的方式对3-MCPD的肾细胞毒性起保护作用。(2)薯蓣皂苷元对3-MCPD肾细胞毒性的保护作用与线粒体密切相关。DIO缓解了3-MCPD导致的线粒体功能紊乱。2、6、8μM DIO单独预处理3 h再与10 m M 3-MCPD协同作用24 h时,3-MCPD诱导的Ca2+超载现象得到缓解;DIO显著提升了由3-MCPD导致的线粒体膜电位降低,对线粒体膜起到稳定作用。进一步研究发现,DIO协同处理时胞内ATP含量得到提升:2、6、8μM DIO与3-MCPD协同处理使胞内ATP含量由3-MCPD处理组的11.60 nmol分别上升到了13.66 nmol、15.13nmol、14.26 nmol;同时,ATP合酶(ATP6、ATP8)的下调表达现象得到改善,这表明DIO处理有利于细胞能量状态的维持。DIO能够通过调控线粒体凋亡通路缓解3-MCPD引起的HEK293细胞凋亡。研究表明,DIO显著降低了3-MCPD处理组的Bax/Bcl2蛋白表达率,缓解了3-MCPD导致的cyt C、AIF从线粒体到胞浆的释放、进一步抑制了线粒体凋亡通路起始因子Caspase9的裂解活化。DIO有利于维持线粒体分裂融合动力学平衡。一方面DIO显著降低了由3-MCPD导致的线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1的上调表达,及DRP1由胞浆向线粒体外膜的迁徙,缓解了线粒体分裂;另一方面,DIO提高了3-MCPD引起的线粒体融合相关蛋白MFN1、MFN2下调表达,促进了线粒体融合。这表明DIO能够通过促进线粒体融合、抑制线粒体分裂来平衡线粒体分裂融合状态。(3)DIO能够通过调控内质网应激反应缓解3-MCPD的肾细胞毒性。研究表明,10 m M 3-MCPD处理24 h时,人胚肾细胞产生了强烈的内质网应激反应。当用4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)抑制3-MCPD诱导的内质网应激反应时,3-MCPD介导的线粒体凋亡受到抑制。主要表现在:3-MCPD导致的胞内Ca2+超载现象得到缓解;线粒体膜电势、cyt C/AIF向胞浆的释放量基本恢复到正常水平。另外,与3-MCPD处理组相比,4-PBA协同处理组凋亡起始蛋白Caspase 9,凋亡执行蛋白Caspase 3/7的酶活性水平显著降低,凋亡起始蛋白Caspase 9的活化受到抑制。DIO缓解了3-MCPD诱导的内质网应激反应和内质网相关性死亡。与内质网抑制剂4-PBA作用相似,DIO协同处理能够抑制细胞内Ca2+超载以及3-MCPD诱导的PERK过量表达。并且DIO协同处理时ATF4、P-CHOP、CHOP、Caspase 12的表达显著下降。然而,与对照组相比,3-MCPD处理组、3-MCPD和DIO协同处理组的内质网应激反应标志蛋白GRP78的蛋白表达量无显著性差异。这表明DIO对内质网胁迫的抑制主要与Caspase 12、PERK-ATF4-CHOP信号通路有关,而GRP78信号在3-MCPD的毒性效应中没有明显作用。由于DIO在抑制内质网应激反应和内质网相关性死亡的同时能调控线粒体途径缓解3-MCPD导致的凋亡,这与内质网应激抑制剂4-PBA的作用效果类似。因此,DIO可能通过调控Caspase 12、PERK-ATF4-CHOP通路先抑制内质网应激反应和内质网相关性死亡,进而实现对线粒体介导的细胞凋亡的抑制。