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二化螟是我国水稻上重要的钻蛀性害虫之一,可造成枯心和白穗等为害症状,进而导致严重的产量与经济损失。二化螟体内具有丰富的酯酶同工酶,并与其杀虫剂抗性密切相关。发掘二化螟酯酶基因资源,可以为害虫田间抗性监测与治理、新型高效“环境友好型”药剂创制与开发以及农药残留环境监测和控制提供基础。 本研究主要内容包括:⑴二化螟酯酶基因CsCaE026的克隆和序列分析。克隆获得二化螟酯酶基因CsCaE026的全长cDNA序列,其开放阅读框为1,671bp,编码557个氨基酸,预测分子量63.66kD,等电点为5.86。预测编码蛋白N-端前16个氨基酸为信号肽序列,且含有α/β-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly和催化三聚体(Ser207、Glu339和His453)等保守结构域以及二硫键结合位点(Cys82和Cys103)等。CsCaE026基因属α-酯酶亚家族。⑵二化螟酯酶基因CsCaE026的原核表达分析。构建获得CsCaE026基因重组表达载体,并在大肠杆菌Rosetta菌株中诱导表达。重组表达产物分子量为70kD,且形成包涵体,未能检测到酯酶活性。提取、纯化重组表达蛋白,并制备获得多克隆抗体。Western杂交结果证实,二化螟CsCaE026基因在大肠杆菌中成功表达。⑶二化螟酯酶基因CsCaE026的时空表达特征分析。分别采用实时荧光定量PCR技术和蛋白Western杂交技术,分析二化螟CsCaE026基因在转录与翻译水平的时空表达分布。明确CsCaE026基因在二化螟幼虫的中肠中高水平特异性表达。⑷二化螟酯酶基因CsCaE026的真核表达分析。构建获得CsCaE026基因重组杆状病毒,并在昆虫Sf9细胞中进行表达。重组表达产物分子量为90kD。Western杂交结果证实,二化螟CsCaE026基因在昆虫细胞中成表达。