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研究背景:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位,在我国其死亡率位居恶性肿瘤之首,胃癌的发生、发展是一个多步骤、多因素进行性发展过程,正常情况下,胃粘膜上皮细胞的增殖和凋亡保持着动态平衡,而这种平衡的维持有赖于癌基因、抑癌基因及众多细胞因子的共同调控。近年来,细胞内信号转导已成为普遍关注的生物学问题,细胞内信号转导调节着多细胞生物的生长、发育、分裂及死亡等生物学行为,与肿瘤的发生发展密切相关,由Smad介导的转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)细胞内信号转导是其中一个重点。Smad蛋白质群是信号转导蛋白,直接参与TGF-β超家族的信号转导,为目前所知的细胞内唯一的TGF-β受体激酶的底物,能将TGF-β信号由胞膜转入核内,Smad经磷酸化后可转导TGF-β后信号,其作用包括细胞增殖、分化及凋亡,TGF-β/Smad信号传导通路是由TGF-β超家族、TGF-β受体、Smad蛋白家族及其核内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路,通路中任一元件异常都可引起TGF-β/Smad信号传导紊乱,导致肿瘤的发生。Smad4是目前在哺乳动物中被确认的唯一共同通道型Smad,在TGF-β超家族信号转导和基因调节事件中起中枢作用。Smad7属于抑制型Smad(Ⅰ-Smad),目前,仅知道Smad7的功能是抑制受体激活的Smad蛋白介导的TGF-β和BMP信号转导,有人把它列为癌基因之列。目前已经证实:Smad4在胰腺癌细胞中失活,其表达缺失与胰腺癌发展、组织细胞分级有关,Smad4表达与胃癌组织的分化程度明显相关,分化越低,表达越少,临床预后较差。Smad4在肝癌组织表达低于同一病理标本的癌旁组织,Smad4在结肠癌中功能性缺失率为30%,在体外对结肠癌细胞转染表达Smad4质粒,发现转染后的细胞蛋白表达水平比对照组细胞增高,G0+G1期细胞百分比增高而S期细胞降低,细胞凋亡比例增加。Smad7蛋白在肝癌组织明显高于同一病理标本的癌旁组织。Smad7在胃癌发生、发展中的表达如何;体外转染Smad4及Smad7质粒后对胃癌细胞有何影响,国内外鲜有报道,本课题应用免疫组织化学染色技术,检测Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达,应用Western-blotting、流式细胞仪及MTT法研究体外转染Smad4及Smad7质粒后对胃癌细胞的影响,以探讨其对与胃癌发生发展的作用机制。第一部分Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达研究目的:研究Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达及作用。方法:病理学证实的胃癌根治性切除的胃癌组织标本78例,胃癌旁组织78例,采用SP免疫组织化学染色技术,检测Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达。结果:1.Smad4蛋白在胃癌旁组织中的阳性表达率为69.23%,在胃癌组织中的阳性表达率为44.87%,二者比较x~2=9.44,p＜0.01;低分化胃癌Smad4蛋白的阳性表达率为26.32%,较高、中分化胃癌Smad4蛋白的阳性表达率62.50%明显减少,差别有显著性(P＜0.01);而高、中分化胃癌的Smad4蛋白的阳性表达率(62.50%)与胃癌旁组织(69.23%)相比差别则无显著性(P＞0.1);有淋巴结转移阳性表达率为23.25%,无淋巴结转移的蛋白阳性表达率为71.43%,差别亦有显著性(x~2=18.10,P＜0.01),38例低分化胃癌中有5例Smad4蛋白表达完全缺失,有1例呈强阳性表达。2.Smad7蛋白在胃癌旁组织中的阳性表达率为17.95%,大部分为弱阳性表达,仅2例为阳性表达,在胃癌组织中的阳性表达率为89.74%,二者比较x~2=80.89,p＜0.01;低分化胃癌Smad7蛋白的表达(97.37%)较高、中分化胃癌(82.50%)明显,差别有显著性(P＜0.05);高、中分化胃癌(82.50%)与胃癌旁组织(17.95%)相比差别有显著性(P＜0.01);有淋巴结转移阳性表达率为97.67%,无淋巴结转移阳性表达率80.00%,Smad7蛋白表达亦有差别显著性(x~2=6.55,P＜0.05),在低分化胃癌中以阳性及强阳性表达为主,而高、中分化胃癌Smad7蛋白的表达则以弱阳性及阳性表达为主。结论:1.Smad4蛋白在胃癌组织中低表达,与癌旁组织比较差异显著(P＜0.01),其表达的阳性率与胃癌的分化程度及转移有关。2.Smad7蛋白在胃癌组织中高表达,与癌旁组织比较差异显著(P＜0.01),其表达的阳性率与胃癌的分化程度及转移有关。第二部分Smad4及Smad7对胃癌细胞的影响目的:体外转染Smad4及Smad7质粒后对胃癌细胞的影响,以探讨其对胃癌发生发展的作用机制。方法:以对数生长期的SGC7901胃癌细胞株为研究对象,将脂质体与Smad4及Smad7复合物1μg、4μg、8μg分别转染细胞,继续培养24h、48h及72h,通过Western-blotting鉴定目的基因表达,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,应用MTT法计算细胞相对存活率,以观察Smad4和Smad7对胃癌细胞增殖的影响。结果:1.转染质粒载体Smad4,Smad7的SGC7901细胞中分别出现了Smad4,Smad7基因表达的蛋白条带,证实Smad4,Smad7基因在胃癌细胞中的表达。2.质粒载体Smad4 1μg、4μg、8μg转染胃癌细胞继续培养24h、48h及72h,1μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:10.2%、15.6%、21.7%;4μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:16.8%、21.8%、28.9%;8μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:22.3%、31.7%、43.6%,随着浓度与时间的增加,胃癌细胞凋亡率增加,以8μg 72h最高。3.质粒载体Smad7 1μg、4μg、8μg转染胃癌细胞继续培养24h、48h及72h,1μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:29.7%、26.5%、16.2%;4μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:24.8%、22.3%、14.8%;8μg 24h、48h及72h后的胃癌细胞凋亡率分别为:21.6%、19.4%、13.3%,随着浓度与时间的增加,胃癌细胞凋亡率反而降低,以8μg 72h的胃癌细胞凋亡率最低。4.MTT法计算细胞相对存活率,以观察Smad4和Smad7不同浓度及时间对胃癌细胞的影响,Smad4的浓度为1μg、4μg、8μg时,细胞相对存活率分别为67.69%、54.80%、32.61%。Smad7的浓度为1μg、4μg、8μg时,细胞相对存活率分别为53.59%、61.48%、67.71%。结论:1.不同浓度的Smad4转染胃癌细胞后,胃癌细胞的凋亡率随浓度及时间的增加而递增,呈浓度及时间的依赖性。2.不同浓度的Smad7转染胃癌细胞后,胃癌细胞的凋亡率随浓度及时间的增加而递减,呈浓度及时间的依赖性。