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本研究在已有研究血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)在乳腺中保护作用的基础上,对该家族的主要成员ACE2在对抗高精料或高水平AngⅡ所致奶牛乳腺氧化应激、炎性损伤及细胞凋亡中的作用及机制进行了探讨。研究包括以下几个方面:1 乳腺局部血管紧张素转化酶2(ACE2)在高精料致奶牛乳腺损伤中的作用初探选用6头健康的泌乳期荷斯坦奶牛,随机分为对照组(精粗比4:6)和高精料组(精粗比6:4),采用单栏定时定量饲喂。饲喂20周后,活体取乳腺组织。进行如下实验:1)测定乳腺组织中·OH、TNOS、SOD氧化应激指标;2)ELISA法测定TNFα、IL-1β 炎性指标和 Caspase-3、Bax、Bcl-2凋亡指标;3)Western Blot 分析乳腺组织中ACE2和ACE的蛋白表达;ELISA法测定Ang Ⅱ和Ang 1-7的含量。结果:高精料长期饲喂,奶牛乳腺组织中·OH浓度显著升高(P<0.01),TNOS及SOD活力降低,其中TNOS活力降低显著(P<0.05);炎症因子TNFα和IL-1β水平均发生显著升高(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平显著升高(P<0.01),抑制凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(P<0.05);乳腺组织中Ang Ⅱ水平和ACE蛋白表达显著升高(P<0.05),Ang 1-7水平和ACE2蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:长期饲喂高精料日粮对奶牛乳腺组织造成一定程度的损伤,引起隐性乳房炎,表现为·OH释放显著增加,抗氧化酶活性降低,组织炎性反应增强导致细胞凋亡。在这个过程中乳腺局部RAS系统被激活,ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴关键成员ACE和AngⅡ水平均显著升高,ACE2-Ang1-7-Mas轴关键成员ACE2和Ang 1-7水平显著降低。结果提示:奶牛乳腺发生应激等损伤时,乳腺局部RAS系统两条轴的平衡失调,ACE2下调导致乳腺高水平的Ang Ⅱ可能是乳腺损伤的主要机制。2 血管紧张素转化酶2(ACE2)在Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞(MAC-T)应激损伤及细胞凋亡中的作用选用牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为研究对象,以AngⅡ诱导细胞损伤,探讨AngⅡ及ACE2的相互作用。研究包括:1)通过检测TNOS活力、·OH浓度、SOD活力和ROS浓度应激指标,确定AngⅡ诱导MAC-T细胞发生氧化应激损伤的合适浓度和时间;2)ELISA法检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;3)Western blot检测细胞中凋亡调节蛋白的表达变化;4)确定细胞中ACE2的细胞学定位,检测ACE2和ACE的蛋白表达,并进行相关性分析。结果:1)Ang Ⅱ可诱导牛MAC-T细胞发生氧化应激,Ang Ⅱ作用浓度为10-8和10-6 mol/L,作用时间为6h;2)与对照组相比,AngⅡ处理组牛MAC-T细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8含量显著(P<0.05)或极显著增加(P<0.01),抗炎因子IL-10含量显著降低(P<0.05);3)与对照组相比,Ang IⅡ处理组牛MAC-T细胞中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达极显著上调(P<0.01),抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P>0.05);4)牛MAC-T细胞中有ACE2存在,细胞定位在细胞膜上。不同浓度AngⅡ处理细胞后,ACE2蛋白表达均有降低,10-6mol/LAngⅡ处理组显著降低(P<0.05);ACE蛋白表达结果相反。ACE2与Ang Ⅱ浓度之间存在显著负相关。结论:AngⅡ诱导牛MAC-T细胞发生氧化应激、炎性损伤和细胞凋亡。在这个过程中ACE2和ACE均处于激活状态,但ACE2降解Ang Ⅱ的作用小于ACE产生Ang Ⅱ的作用,即ACE2的降解作用处于劣势。结果提示:ACE2/ACE轴的失衡是Ang Ⅱ诱导损伤的主要原因。3 血管紧张转化酶2(ACE2)抵抗AngⅡ诱导MAC-T细胞损伤的机制初探上一章的实验发现ACE2与AngⅡ致细胞损伤的程度呈显著负相关,提示ACE2可能具有一定的抗损伤作用,为了进一步阐明ACE2在Ang Ⅱ诱导的MAC-T细胞损伤中的抵抗作用,本章实验通过给予外源性ACE2活性蛋白处理细胞,通过氧化应激、细胞炎性因子等指标测定,明确ACE2在Ang Ⅱ诱导的乳腺细胞损伤中的抗损伤作用,并通过分析细胞RAS成员ACE2、ACE、Ang1-7、AngⅡ的表达或含量变化,揭示ACE2抗损伤作用的可能机制。结果:加入ACE2活性蛋白后1)细胞ROS、·OH产生均减少,TNOS和SOD活力升高;2)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8含量均降低,抗炎因子IL-10的释放增多;3)细胞中促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Caspase-3相比于AngⅡl处理组表达量下降,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量升高;4)细胞中AngⅡ含量显著降低,Ang 1-7含量显著升高。结论:ACE2对Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞氧化应激、炎性损伤和细胞凋亡均有一定的抵抗作用。其作用机制一方面通过ACE2降解AngⅡ,减少AngⅡ的生成,另一方面通过其下游产物Ang 1-7,拮抗和抑制AngⅡ的作用。