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组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立(1)将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养(DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基),5d后消化传代。(2)对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究(1)本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。(2)细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。