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Bim是Bcl-2凋亡蛋白家族中仅有一个BH3同源结构域的蛋白，能够和Bcl-2家族中一些促生存亚家族成员如Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL结合，中和其活性，因此Bim被称作Bcl-2家族促生存成员的死亡配体，Bim和Bcl-2促生成蛋白因子的比例与Bim诱导凋亡有关。此外Bim蛋白还能够上调Bax亚家族促凋亡蛋白水平。在哺乳动物中，Bim前体mRNA由于不同的剪接方式会形成三种亚型:即BimS(Bim short)、BimL(Bim long)、BimEL(Bim extra long)。一般情况下，BimEL含量最高，BimS含量最少，但是BimS促凋亡活性最强。 金鱼（Carassius auratus），属于鲤科鱼类，早在南宋时期就作为观赏鱼类饲养。金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一，具有鳃形态重塑等独特的低氧适应机制。在缺氧、温水甚至运动状态下，金鱼鳃间嵌入式细胞团（Interlamellar Cell Mass，ILCM）减少，使鳃表面积增加，从而显著增加对水体中溶解氧的吸收能力。在鲫鱼和金鱼中发现的鳃形态的可塑性后，一些鱼类可逆地重塑鳃形态的能力已经成为研究重点。 HIF-1α通常被认为是许多低氧诱导反应的主要开关，在缺氧环境中HIF-1α稳定且表达升高。多种miRNA具有抑制细胞凋亡的作用，miR-24就是其中之一，并且miR-24的表达受低氧诱导因子HIF-1α的诱导，而Bim是miR-24下游的一个靶基因。目前，金鱼ILCM凋亡分子机制尚不明确，研究Bim基因对金鱼适应低氧和高温环境中ILCM凋亡机制的影响，对阐明金鱼适应低氧与高温的作用机理具有重要的意义。另外，对金鱼鳃形态可逆性重塑的研究，为通过基因工程培育抗逆性强的水产养殖新品种提供有益思路。 为了探究Bim基因对金鱼鳃间ILCM细胞凋亡作用，本研究主要运用DNA重组技术、荧光定量PCR、Western Blot和RNApull-down等实验技术展开研究，具体内容如下: 1.金鱼Bim基因克隆及抗体制备 PCR克隆金鱼Bim基因编码区序列，获得两条长度为546bp和213bp的Bim CDS区序列，编码蛋白分别为182、71个氨基酸，推测是由于Bim基因不同的剪切形式形成的两种Bim亚型。通过对金鱼、斑马鱼和人的Bim氨基酸序列比对，选择肽链“VARELRRIGDEFNRLYC”作为制备金鱼Bim特异性抗体的抗原决定簇，成功获得特异性的Bim抗体。利用3RACE技术扩增出长2952bp的Bim3-UTR序列，并构建pGEM-T-Bim-3-UTR载体，序列分析表明金鱼Bim mRNA3UTR区包含9个富含AU的元件(AUUU～UA，AU-rich elements，AREs)。 2.miR-24及Bim在金鱼低氧适应中的差异性表达分析 取健康金鱼随机分组，每组6条，分常氧组（溶氧量为8.5～9.5ppm）、低氧组（溶氧量1.8～2.1ppm）、低氧ERK抑制剂组培养8h后，解剖取样。取鱼鳃组织用戊二醛固定，经过脱水与干燥后，用超景深显微镜观察发现，与常氧条件相比，低氧条件下金鱼鳃间ILCM明显减少，而12.5mg/kg ERK抑制剂处理可部分抑制低氧条件下金鱼鳃间ILCM细胞团的减少。荧光定量PCR分析表明，低氧能显著提高金鱼miR-24表达水平，同时金鱼鳃组织中Bim mRNA水平无显著差异。Western Blot实验检测Bim蛋白表达情况，低氧条件下，Bim蛋白表达量较常氧处理组下降，注射ERK抑制剂导致Bim蛋白水平显著上升。由此推测，在低氧环境中miR-24的过表达和ERK1/2激酶的激活降低Bim的蛋白水平，从而促进金鱼ILCM细胞团的减少，ERK抑制剂处理可抑制低氧诱导的Bim蛋白水平的降低，和金鱼鳃组织ILCM细胞团的减少。 3.金鱼温度胁迫中Bim表达分析及RNA Pull-down分析 取健康金鱼随机分组，分别设置温度为10℃、17℃、25℃的培养组，每组6条，培养24h后，解剖取样。荧光定量PCR分析表明，随着温度升高，Bim mRNA和蛋白相对表达水平降低。为进一步探索不同温度影响Bim mRNA水平的原因，我们采用RNA pull-down法分析不同温度对热休克蛋白HSC70和HSP40与Bim mRNA结合的影响。 我们克隆出了金鱼HSC70和HSP40基因并构建原核表达载体pET32a-HSC70和pET32a-HSP40，通过IPTG诱导原核表达获得Trx-HSC70和Trx-HSP40重组蛋白。用SalⅠ限制性内切酶对pGEM-T-Bim-3-UTR进行单酶切得到线性Bim3-UTR DNA，通过体外转录和生物素标记获得Biotin-Bim-3-UTR RNA，亲和素树脂富集Biotin-Bim3-UTR RNA后，向树脂中加入等量要检测的Trx-HSC70或Trx-HSP40蛋白，分别置于10℃、17℃、25℃摇床上孵育3h。Western blot分析不同温度下HSC70与Biotin-Bim3-UTRRNA结合能力的差异。在HSP40蛋白协同作用下，在一定范围内，温度越高，HSC70蛋白结合Bim mRNA3-UTR区的能力越弱。表明高温降低了HSC70蛋白与Bim mRNA3-UTR区的结合水平，从而抑制了HSC70对Bim mRNA的稳定作用，这也与25℃处理下Bim蛋白水平的降低吻合。 本研究表明低氧与高温分别通过ERK/miR-24和HSC70/HSP40抑制Bim的表达水平，并诱导金鱼鳃组织ILCM细胞团的减少。Bim同时具有促进细胞凋亡和促进细胞生存的双重调节功能，推测在金鱼ILCM细胞团中Bim主要发挥促细胞生存作用。Bim双重调节功能的具体作用机制可能与特定细胞类型有关，还需要进一步的研究。