革兰氏阴性细菌导致的植物细菌性病害超过250种,此类细菌性植物病害造成大量的植物减产和经济损失。而柑橘溃疡病(Citrus Bagtedal Canker Disease,CBCD)是其中一种重大植物病害,在超过30个国家广泛分布,该病能够造成重大的柑橘业损失。在疫区,传统的柑橘溃疡病防治方法大多采用铜制剂和农用抗生素,不仅效果不佳,反而造成大量的红蜘蛛泛滥和抗生素与重金属离子的超标;对于严重发病的柑橘溃疡病感染植株,一般只能采取焚烧的方式阻止其扩撒。芽孢杆菌作为一类常用的具有生物防治作用的菌株,对植物病原菌和柑橘溃疡病有良好的防治效果。对其抗菌基因和抗菌物质的筛选和研究,有利于阐述生物防治机制和高效生防菌的筛选应用。本研究以解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株(Bacillus amyloliquefaciens CQBA03)和柑橘溃疡病病原菌(Xanthomonas citrus subsp.citrus.Xcc)为研究对象,通过构建Fosmid文库的方式,构建解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组文库克隆。对其文库进行诱导、定向筛选,获得抗柑橘溃疡病病原菌的克隆。经克隆、测序、生物信息学分析、纯化、表达抗菌基因,揭示了该菌株相关抗菌物质的代谢通路并获得了一种新的分泌型抗菌蛋白。同时以解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株外分泌的D型氨基酸入手,研究了D型氨基酸对柑橘溃疡病病原菌的变形、致死作用,并且测定了实验室条件下,D型氨基酸对柑橘溃疡病的防、治效果。研究为阐述CQBA03菌株抗菌机制和应用提供了理论依据。①解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组Fosmid文库的构建建立了解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组Fosmid文库,共获得约2,3000个文库克隆。文库容量920Mb,本文库容量在CQBA03菌株基因组244~263倍左右,平均容量是解淀粉芽孢杆菌基因组的256倍。随机外源插入片段为36kb~50 kb,平均大小为45 kb,其中约40.8%的插入片段大小在31kb到35kb之间,约36.0%的插入片段在35kb到40kb之间。空载率小于1.5%。②抗溃疡病病菌克隆的获得和分析1)通过在牛奶平板筛选培养基上,4℃条件下诱导,从10,000个文库克隆中,筛选出了66个具有外分泌蛋白酶的文库克隆。从中我们筛选了1株具有最强外分泌蛋白酶功能的抗柑橘溃疡病克隆子进行DNA测序。2)将克隆通过454测序后,得到长度为58,785bp的序列,GC=49.13%。经生物信息学分析,预测到344个开放阅读框。对比后发现,与已知基因相似的ORF有75个,其中25个基因与抗微生物有关,生理生化相关酶类26个,昆虫毒性蛋白1个(insecticidaltoxindomainprotein);其余23个为功能未知的蛋白质,占总已知序列75个的30%。对所得序列进行代谢通路分析得到24条完整的代谢通路,其中与抗菌相关的通路包括酮的合成与降解(synthesisanddegradationofketonebodies),并首次从解淀粉芽孢杆菌基因组获得12、14和16三种大环内酯类抗生素生物合成(biosynthesisof12、14and16-memberedmacrolides)通路。③抗菌基因的获得、表达、纯化1)通过序列分析,筛选出7个可能与抗菌相关的基因序列,经pcr扩增和连接,克隆于pmd19t载体并进行了抗柑橘溃疡病功能测定。从中筛选出一个抗柑橘溃疡病的小肽基因,该基因长度132bp(登录号bankit1690482),编码一个43aa的小肽:其信号位点27-28aa,分子量(molecularweight)4772da,等电点(pi)6.38。通过比对,该基因与线性短杆菌肽酶的缩合区具很高同源性,此基因目前还未被报道过,为一新功能的基因。2)构建原核表达载体,融合表达了带有his-tag标签的蛋白。通过构建原核表达载体,诱导表达和纯化,成功获得电泳纯的带有his-tag标签的融合蛋白,该融合表达蛋白大小21kd,但是融合蛋白失去其抗菌功能。④d型氨基酸抗菌作用的发现1)通过分析解淀粉芽孢杆菌cqba03菌株外分泌培养液中d型氨基酸的含量,发现解淀粉芽孢杆菌cqba03菌株分泌的一定浓度的d-亮氨酸(d-leucine),对柑橘溃疡病菌有增大菌体,使菌体分裂不正常的现象。2)通过光学显微镜和扫描电镜检测研究,发现7mm的d-leu能够使柑桔溃疡病菌(xcc)菌体形态发生明显改变,干扰xcc细胞分裂,使短杆状的细胞成为长线状。形态变化可以分为4个明显的形态时期①菌体增大期。②链状菌体期,③原生质膨胀期,④空泡期。最终d-亮氨酸导致柑橘溃疡病病菌在24h内死亡。3)通过荧光染料发现,在7mm浓度d-leu处理下xcc菌体在1h内可导致部分菌体急性死亡;未死亡菌株在6h时变为链状,菌体失去运动的能力。在处理10h时,菌体保持长线状,但是细胞膜已经破损死亡。4)论文对多种d型氨基酸对柑橘溃疡病菌的mic(最小抑制值)进行了测试。结果发现,d-leu对柑橘溃疡病菌xcc的mic为7mm、d-phe为18mm,而d-val为15mm。l-leu、l-phe、l-val,在50mm浓度下不影响xcc菌生长和形态。5)测定了d-亮氨酸处理对柑橘溃疡病菌细胞壁氨基酸成分的影响。结果显示,7mm浓度d-leu处理组的柑橘溃疡病细菌细胞壁肽聚糖中,20种氨基酸呈现先上升(3h)后下降(24h)的趋势,其中arg、ser、leu在培养3h后含量比例显著下降,但在24h时含量恢复至原水平或更高;有12种氨基酸在d-亮氨酸处理后显著下降,而cys的含量在处理3h后含量比例由对照的约2%降低到不可检出。6)D型氨基酸在实验室条件下对柑橘溃疡病的防控效果在实验室条件下以离体柑橘叶片接种柑橘溃疡病菌,并以D-亮氨酸处理研究发现,D-亮氨酸处理柑橘叶片后接种溃疡病菌及溃疡病菌接种柑橘叶片马上以D-亮氨酸处理,可以显著降低离体叶片发病率,但接种病原菌1天后以D-亮氨酸处理不能阻止溃疡病症状。说明D-亮氨酸在预防柑橘溃疡病病菌入侵方面效果显著,但是对已经入侵的柑橘溃疡病病菌防治效果不明显。