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人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBo V1)是细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属的成员之一。HBo V1的感染部位是人体呼吸道,会引起严重的呼吸道疾病,最常见的症状是急性哮喘,在6个月到2岁的婴幼儿当中感染率较高,对人类健康具有极大危害。NS1是HBo V1的主要非结构蛋白,可以通过可变剪接和多聚腺苷酸加尾的机制形成编码大小约100k Da的NS1蛋白(NS1-100),而未经过可变剪接的编码大小约70k Da的NS1蛋白(NS1-70)。NS1作为细小病毒科的多功能蛋白,在细小病毒的复制、转录激活、引发细胞凋亡和细胞病变效应等方面发挥着重要作用。反式激活作用作为NS1蛋白的最主要功能之一,可以显著提高病毒基因组转录水平,加速病毒在细胞内的增殖。HBo V1的NS1蛋白反式激活功能研究,对于进一步深入探讨HBo V1的NS1在病毒复制过程的作用机制具有重要意义。本研究以HBo V1 WHL-1(NCBI登录号:GU139423)的基因序列设计特异性引物,用本实验室前期构建的p WHL-1质粒为模板,通过PCR扩增获得NS1-100和NS1-70目的基因,并将其分别克隆到慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-Zs Green1上,获得慢病毒表达重组质粒p LVX-NS1-100和p LVX-NS1-70,然后与ps PAX2,p MD2.G质粒共转染HEK293T细胞,于转染后72h收集细胞培养上清,获取慢病毒原液,对病毒原液进行纯化浓缩后获得浓度为1×105 TU/m L的病毒浓缩液,取100μL病毒浓缩液感染HEK293T细胞,待在荧光显微镜下观察细胞均发出荧光后进行扩大培养,用含有嘌呤霉素(4μg/m L)培养基筛选10~14天左右,几乎所有存活细胞都表达绿色荧光蛋白,即初步成功构建稳定表达NS1-100和NS1-70细胞系。同时,我们将慢病毒重组质粒转染HEK293T细胞后,利用有限稀释法挑取表达目的蛋白的单克隆细胞进行扩大培养,用含有嘌呤霉素(4μg/m L)培养基筛选10~14天左右,几乎所有存活细胞都表达绿色荧光蛋白,即初步成功构建了稳定表达NS1-100和NS1-70的细胞系。将得到的稳定细胞系收样后进行WB检测,NS1-100蛋白和NS1-70蛋白表达量均较高,即成功构建了稳定表达NS1-100和NS1-70的细胞系。将NS1-100和NS1-70目的基因分别克隆到真核表达载体p CAGGS上,获得真核表达重组质粒p CAGGS-NS1-100和p CAGGS-NS1-70,然后分别与p GL3-HBo V1质粒或p GL3-CMV质粒共转HEK293T细胞,24h后检测双荧光素酶活性。结果显示瞬时表达NS1-100蛋白后,HBo V1启动子活性为阴性对照的2.24倍,为CMV启动子活性的1.96倍;瞬时表达NS1-70蛋白,HBo V1启动子活性为阴性对照的2.1倍,为CMV启动子活性的1.64倍。将p GL3-HBo V1质粒或p GL3-CMV质粒分别转染稳定表达NS1-100蛋白或NS1-70蛋白的HEK293T细胞系,24h后检测双荧光素酶活性。结果显示稳定表达NS1-100蛋白后,HBo V1启动子活性为阴性对照的4.6倍,为CMV启动子活性的6.8倍;稳定表达NS1-70蛋白后,HBo V1启动子活性为阴性对照的4.1倍,为CMV启动子活性的10倍。在稳定表达细胞系中HBo V1启动子活性均比瞬时表达中的活性强,构建一个可调控的稳定表达细胞系为进一步深入研究NS1蛋白参与反式激活的机制提供体外细胞实验模型。有助于全面认识HBo V1的非结构蛋白NS1的功能及其作用机制,并为其他细小病毒的NS1的功能及其作用机制研究提供重要参考。