论文部分内容阅读
脂代谢紊乱会对人体造成许多危害,如引起高血脂,脂肪肝等。荞麦是一种药食同源的传统作物,对肥胖、高血糖和高血脂等代谢性疾病具有良好的预防作用,荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)是从荞麦中提取的一种低分子量蛋白质。本研究采用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为模型,检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI)对线虫脂肪积累的影响,并初步研究了其作用机制。主要研究内容和结果如下:1.rBTI对秀丽隐杆线虫脂肪积累的影响。采用尼罗红染色及甘油三酯测定检测脂肪变化情况,结果显示,在2.5-10μM浓度范围内,rBTI可以降低野生型线虫脂肪积累,并且呈现一定浓度依赖效应。与对照相比,10μM rBTI处理的线虫体内脂肪积累减少了37.82%,甘油三酯减少了47.51%。用0.75%葡萄糖建立高脂模型线虫,研究rBTI对线虫脂肪积累的影响,结果发现在高脂模型线虫中,经rBTI处理后,线虫脂肪积累减少了38.6%,甘油三酯减少了38.57%,表明rBTI在正常和高糖饮食条件下都会减少脂肪积累。另外,rBTI可以明显减小线虫身体宽度,但对线虫的身体长度、运动能力和产卵能力不会产生显著影响,表明rBTI降低脂肪积累的作用与线虫的运动及生殖等行为无关。2.rBTI减少秀丽隐杆线虫脂肪积累机制。通过检测rBTI作用后三种突变体线虫的脂肪积累研究了rBTI降低脂肪积累的机制。结果显示,rBTI可以减少eat-2突变体(饮食限制模型)中的脂肪积累,而对daf-2和daf-16突变体的脂肪积累没有明显减少作用。daf-2和daf-16是胰岛素信号通路(IIS)的关键因子,表明rBTI减少线虫脂肪积累的作用依赖于IIS途径,而并不依赖于饮食限制信号通路。利用转基因C.elegans检测编码脂肪酶基因lipl-4的表达水平,结果显示rBTI提高了lipl-4的表达水平,表明线虫体内脂解作用增强。转录因子DAF-16可以调节小肠中lipl-4表达,表明rBTI通过IIS通路调控lipl-4的表达,进而加强了脂解作用。采用了酶活检测、qRT-PCR和突变体线虫脂肪积累检测三种方法进一步研究了rBTI对脂肪合成的影响。酶活测定显示,rBTI降低了参与脂肪合成的两种关键酶ACC和FAS的活性;qRT-PCR结果表明rBTI下调了参与脂肪合成的关键基因sbp-1、pod-2和fasn-1的表达,sbp-1是pod-2和fasn-1上游基因;同时,sbp-1、pod-2和fasn-1三种线虫突变体的脂肪积累检测结果显示,在这三种突变体中,rBTI减少脂肪积累的作用均消失,表明rBTI发挥减少脂肪积累的功能需要sbp-1、pod-2和fasn-1这三个基因。这些结果表明rBTI通过调控sbp-1的表达减少了脂肪合成。利用定点突变技术对rBTI活性位点突变得到了具有不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,并进一步检测了各突变体对线虫脂肪积累的影响。结果显示,当胰蛋白酶抑制活性丧失(rBTI-R45F)、较低(rBTI-W53R)及显著升高(rBTI-P44T)时,与rBTI相比,突变体对线虫脂肪积累减少的作用均降低,表明rBTI减少脂肪积累与其一定的胰蛋白酶抑制活性相关,当活性改变,其减少脂肪积累的效应就会降低或消失。然而,rBTI的降脂作用与其分子结构的关系还有待进一步研究。综上所述,本研究表明,rBTI通过下调IIS途径增强了脂肪分解相关酶的转录及表达,并通过下调sbp-1降低了脂肪合成相关酶的活性,减少了脂肪合成,从而具有降低线虫脂肪积累的作用。3.rBTI处理秀丽隐杆线虫后转录组数据分析。采用高通量测序方法对对照组和10μM rBTI处理组线虫进行转录组测序,得到两组间的差异表达基因,并对其差异基因进行GO功能注释和富集,分析了rBTI在微观水平上对线虫的影响。结果显示,与对照相比,rBTI处理后,差异表达基因有283个,其中有57个基因显著上调,226个基因显著下调。经过GO功能注释可知,在rBTI处理下,显著上调的基因有cyp-14A1、acdh-1、hsp-16.1、hsp-16.2、hsp-16.70,显著下调的基因有scp-1、sbp-1等。scp-1、sbp-1均与脂肪酸合成相关,与之前结果一致,scp-1、sbp-1表达下调表明rBTI可减少线虫脂肪合成;而cyp-14A1、acdh-1的下调表明脂肪酸氧化分解加快,进一步确定了rBTI可以减少脂肪积累。热休克蛋白家族因子hsp-16.1、hsp-16.2、hsp-16.70表达上调,表明rBTI可以增强线虫对热应激的抵抗。除此以外,分析结果显示rBTI对线虫免疫系统等产生一定影响。以上结果表明rBTI是荞麦中一种重要的生物活性物质,具有预防肥胖的可能。本研究结果为进一步开发荞麦的功能提供了一定理论依据。